阅读量：

161

作者：

贾文广

展开

摘要：

目的:地中海贫血是危害严重的遗传性溶血性疾病.重型β-地中海贫血需要终生依赖输血和祛铁治疗,治疗费用昂贵,死亡率极高,给病人,家庭和社会带来巨大的负担.对高危夫妇实施胎儿产前诊断是避免重型患儿出生的唯一有效途径.目前国内外对地中海贫血的产前诊断方法主要是有创的产前诊断技术,不可避免会存在对母体和胎儿的伤害.因此,安全有效的无创性产前诊断技术一直是地中海贫血等遗传性疾病产前诊断研究的方向和目标.本研究拟应用高通量目标区域捕获测序和假四倍体基因型生物信息分析方法,对高危孕妇血浆游离胎儿DNA实施β-地中海贫血基因突变检测,探讨创建安全,有效和准确的无创性产前检测体系,为β-地中海贫血产前诊断提供新的技术和实施方法. 方法:课题选取的研究对象为双方均携带β-地中海贫血基因突变,可能生育重型β-地中海贫血患儿的夫妇.孕妇孕周为12周-26周,单活胎,拟进行胎儿产前诊断.对孕妇实施绒毛膜穿刺,羊膜腔穿刺或脐静脉穿刺,提取胎儿DNA,应用反向斑点杂交法和荧光PCR溶解曲线法进行胎儿DNA地中海贫血基因诊断.同时采集孕妇外周血,提取血浆游离DNA.设计针对中国人群常见的12种β-地中海贫血基因突变类型的目标区域捕获基因panel,将孕妇外周血游离DNA进行文库构建,并与基因panel杂交,进行目标区域捕获高通量测序.利用高通量测序信息,根据胎儿基因型,孕妇外周血游离胎儿DNA浓度,孕妇与胎儿共存的假四倍体基因型三者之间的关系,建立假四倍体基因型生物信息分析方法.通过最大似然估计,不断的迭代出胎儿的最优浓度.利用贝叶斯模型得到每个位点最优基因型,利用基因型与胎儿浓度的对应关系估算出最准确的胎儿浓度,不断的迭代直到前后两次浓度之差小于0.001,从而得到的最优的胎儿浓度,进而得到对应的胎儿基因型.将孕妇外周血游离胎儿DNA的胎儿基因型与有创产前检测胎儿基因型结果进行对比,将假四倍体基因型分析模型预测的游离胎儿DNA值与实测值对比,以检验本研究方法的效能. 结果:1.一般资料:146组入组病例中,有133组病例样本符合本研究要求.其中孕妇的年龄为28.47±6.05岁(16岁至47岁),孕周为15.24±3.31周(12.0周至26.4周),身高为156.44cm±5.02cm(145cm至171cm),体重为54.78kg±7.84kg(40.5kg至79.0kg),BMI为20.3±3.2m2/kg(18.4kg/m2至23.98kg/m2).2.孕妇外周血游离DNA文库浓度测定及FF值结果:孕妇外周血游离DNA文库浓度为20.3ng/μl±12.8ng/μl,DNA文库浓度与孕周之间成正性线性关系.妊娠第12周,13周及18周的孕妇外周血游离DNA文库浓度与年龄无相关性,即孕妇年龄对孕妇外周血游离DNA浓度无影响.孕妇外周血游离游离胎儿DNA浓度(fetal fraction,FF值)预测值为10.26%±5.82%,实测值为11.37%±6.86%.FF值与孕周之间成正性线性关系.妊娠第12周,13周及18周的孕妇FF值与年龄无相关性,即孕妇年龄对FF值无影响.3.绒毛,羊水或脐带血胎儿基因型结果:反向斑点杂交法和荧光PCR溶解曲线法检测结果一致.突变位点的双重杂合子15例,突变位点的纯合子7例,突变位点的杂合子79例,无突变32例.包含了以下基因突变类型:CD41/42,CD17,CD71/72,CD43,-28,-29,IVS-Ⅰ-Ⅰ,IVS-Ⅱ-654和HbE.4.血浆游离DNA文库质量检测结果:133例孕妇外周血DNA文库,质量鉴定显示,主峰吸收光谱200bp-400bp之间,峰图高而尖,线条平滑;第二峰范围在400bp-1000bp,峰图矮而钝;Lower marker后无明显峰图.高通量测序时DNA文库读长吸收峰均值为167bp±8bp.5.目标区域高通量测序结果:133例合格DNA文档库的平均测序深度为379.475×±172.928×,120例(90.22%)测序深度超过200×;pool池的累计测序深度600×.Real reads为7825310.57±1254716.368,Q30rate为81.8317%±2.09838%;GC含量41.0253%±0.8747%.构建pool池的DNA浓度为16.5nmol/L,每个DNA文库样本测序数据量为4.2M时,高通量测序效率/成本比最高.突变位点总文库数181,捕获的有效文库数161,捕获效率88.95%;对CD41/42位点的捕获效率为85.14%,在其他区域的捕获效率为91.59%.6.假四倍体基因型生物信息分析结果:与有创产前检测结果相比,有113例结果符合;有20例结果不符合,包括11例CD41/42,3例CD17,2例-28,1例CD43,1例CD71/72及2例IVS-Ⅱ-654等基因突变.其总体符合率为84.96%.7.假四倍体基因型分析方法的效能评估结果:对FF预测值和FF实测值两组数据进行配对样本的t检验,t=0.436,P=0.762.基因型评估结果Kappa系数为0.71,总敏感性为83.5%(95%CI:61.6%-93.2%),特异性为92.8%(95%CI:76.7%-97.9%). 结论:1.针对中国人群常见的12种β-地中海贫血基因突变类型设计的基因panel,能较好捕获相应基因位点.2.孕妇外周血游离DNA浓度随孕周增加而增加,但与孕妇年龄无关.孕妇外周血FF值随孕周增加而增加,但与孕妇年龄无关.3.假四倍体基因型生物信息分析方法,可直接推测出胎儿基因型和游离胎儿DNA在孕妇外周血游离DNA中的比例,其用于β-地中海贫血无创产前检测具有可行性.4.基于高通量测序和假四倍体生物信息分析方法的β-地中海贫血无创产前检测的方法,无需已知先证者,无需获取夫妇双方基因遗传信息,无需构建RHDO及RMD模型,即可对胎儿进行产前检测.5.基于高通量测序和假四倍体生物信息分析的方法理论上适用于符合孟德尔遗传定律的单基因遗传病.

展开

关键词：

高通量 测序 四倍体 生物 信息分析法 地中海贫血 无创

学位级别：

博士

学位年度：

2019