文章来源：中国防痨杂志，2023，45(3)：253-259

doi：10.19982/j.issn.1000-6621.20220391

作者：夏辉1，王瑞白2，赵雁林1

作者单位：

1中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心/国家结核病参比实验室，北京102206

2中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病室，北京102206

通信作者：王瑞白

摘   要  ★

中国是结核病及结核分枝杆菌潜伏感染高负担国家。结核分枝杆菌潜伏感染及活动性结核病的治疗管理和预后完全不同，现有潜伏感染诊断技术并不能有效预测和鉴别活动性结核病的进展和发生。因此，需要探索更加准确的生物标志物。本文主要就结核分枝杆菌潜伏感染和活动性结核病鉴别诊断生物标志物研究进展及问题进行总结和归纳，并展望其发展方向。

关键词：分枝杆菌，结核；感染；生物学标记；诊断，鉴别；总结性报告(主题)

我国既是结核病高负担国家，也是结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)高负担国家。2021年，估算我国有78万例(66.5万例~90.5万例)结核病患者。2013年我国5岁及以上人群结核分枝杆菌潜伏感染率为18.08%，15岁及以上人群潜伏感染率为20.34%，呈现随年龄增长而增高的趋势。普遍认为，约5%~10%未经治疗的LTBI者在一生中会进展为结核病，但很多研究支持大多数LTBI者中位潜伏期为数月至2年，只有小部分人是2年后患结核病。因此，鉴定出近期进展为活动性结核病甚至是已经处于活动性结核病早期的患者非常重要。目前，活动性结核病确诊主要依靠病原学检查，但即使经过多方面努力，尤其是大力推广结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)核酸分子生物学检测技术，2021年我国结核病患者病原学确诊的比例也仅达到58%，即约40%的患者为临床诊断疑似病例。因此，活动性结核病的诊断除了继续改善病原学检测技术外，基于免疫学或其他生物标志物的检测方法也成为另一热点和方向，以弥补疾病早期阶段菌量极低或由于感染部位不同而不排菌的病原学阴性患者的诊断。

一、现有免疫学检测技术的局限性

目前应用最多的基于宿主免疫反应的技术主要有结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)和γ-干扰素释放试验(interferon-gamma release assay，IGRA)。这两类方法检测的是个体之前是否暴露过MTB，但对预测将来何时发展活动性结核病或鉴别现在是否为活动性结核病效果并不理想。因为人体暴露于MTB后，大多数MTB免疫反应性个体清除了感染，但同时保留了对它的免疫记忆。IGRA更新产品Quantiferon-Gold Plus额外增加了用于刺激MTB特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞的抗原，以期实现不同感染阶段的识别，但基于既往的研究并没有显示出其有明确的有效鉴别LTBI和活动性结核病的能力。除了传统的 TST 之外，基于重组早期分泌抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)抗原的新型皮肤试验如C-TST(安徽智飞龙科马生物制药有限公司)可以解决因卡介苗接种和非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)感染出现的TST假阳性问题，但因与IGRA使用类似的抗原进行刺激，因此，其用于鉴别LTBI和活动性结核病的能力预计与IGRA类似。尽管我国肺结核诊断标准中这些技术可以作为活动性结核病的辅助诊断方法，但是世界卫生组织明确IGRA和TST这两类方法不能在中低收入国家用于诊断结核病及肺外结核，包括合并HIV者，因这两种方法的敏感度和特异度及证据质量均很低。IGRA在疑似结核病患者中检测活动性结核病的敏感度为73%~83%，特异度为49%~58%，意味着50%的阳性结果用于诊断活动性结核病时是假阳性。另外，没有证据表明IGRA在诊断活动性结核病方面比传统的微生物检测更有价值。

二、鉴别LTBI和活动性结核病生物标志物研究进展

LTBI至发生活动性结核病是一系列具有特定微生物学和免疫学特征的异质性过程。基于此，可以推测潜伏感染部位像活动性结核病病灶一样包含不同状态的细菌群体，既有易于被抗结核药物控制的活跃复制的MTB，也有耐受药物的代谢静止的MTB。MTB感染后处于何种状态是宿主-微生物相互作用的结果。每个阶段宿主遭受的损伤程度可能有所不同。因此，目前关于LTBI和活动性结核病鉴别诊断研究的挑战可以理解为确定从哪个阈值开始相对静止的感染转变为活动性，即早期疾病发生。这种阈值的确定对于免疫功能正常的宿主与免疫抑制或缺陷的宿主可能并不相同。因此，开发更好的可以区分LTBI和活动性结核病的诊断技术需要更多了解MTB及其宿主反应。

(一)免疫学检测新型抗原

目前广泛使用的抗原如ESAT-6和CFP-10是因为它们对MTB感染的高免疫原性和特异性，而不是因为它们预测LTBI进展为活动性结核病或鉴别活动性结核病的潜力。ESAT-6被认为是最具免疫原性的蛋白质之一，但它在整个潜伏期及感染的活动阶段都会分泌，因此，使用其作为抗原无法进行良好的疾病阶段特异性诊断，基于这些抗原免疫反应的诊断技术(如新型TST和IGRA)区分LTBI和活动性结核病的能力也有限。因此，额外加入潜伏期阶段特异性的抗原或使用替代抗原可以作为一种新思路来鉴定不同的MTB感染阶段。

LTBI中T细胞对MTB的一组潜伏期[休眠期生存调节因子(dormancy survival regulon，DosR)]和复苏促进相关抗原[复活促进因子(resuscitation promoting factor，Rpf)]的反应明显高于活动性结核病。一项系统综述显示，已有300余种新型MTB抗原被关注和研究，其中，Rv2031c、Rv2029c、Ag85复合物抗原、Rv0475[肝素结合血凝素(heparin-binding adhesin，HBHA)编码基因]、Rv2628、Rv1733c、Rv1737c、Rv0081、Rv2032、Rv0867c和Rv2389c成为研究热点。这些抗原中大多数属于DosR的一部分，少部分(如Rv0867c和Rv2389c)属于Rpf。Rv0081、Rv1733c、Rv1737c、Rv2029c、Rv2031、Rv2628、HBHA等是研究最广泛的抗原，且在不同的研究和地区中均显示出很好的免疫原性。考虑到差异区域(region of difference，RD)抗原是MTB特异性的，为了在卡介苗接种地区也能获得良好的鉴别能力，Gong和Wu从MTB的133种RD相关抗原和124种潜伏期相关抗原中找出交集的21种潜伏期特定的RD相关抗原，包含Rv1736c、Rv1737c、Rv2031c、Rv2626c、Rv2653c、Rv2654c、Rv2656c、Rv2657c、Rv2658c、Rv2659c、Rv2660c、Rv1511、Rv1978、Rv1980c、Rv1981c、Rv3872、 Rv3873、 Rv3878、 Rv3879c、 Rv3425和Rv3429。这些LTBI阶段特异性新抗原结合γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)或其他细胞因子的测量在LTBI者和活动性结核病患者中存在差异，进而可以用于提高LTBI和活动性结核病的鉴别能力。因此，针对这些潜伏感染阶段特异性的抗原或许可以作为LTBI的确定(rule in)方法，但在临床队列研究中的表现仍需要更多的证据支持。

(二)细胞因子或其他分析物

MTB暴露后引起的免疫反应并不限于INF-γ的释放，通过测量响应MTB抗原产生的其他细胞因子和(或)趋化因子等可以提高鉴别活动性结核病和LTBI的能力。很多研究将干扰素诱导蛋白10(CXCL10/IP-10)作为IFN-γ的潜在替代生物标志物。IP-10响应IFN-γ信号由单核细胞、中性粒细胞和其他细胞大量产生，从而放大Th1 CD4+T细胞对抗原刺激的IFN-γ反应，参与将Th1细胞运输到炎症区域，在该区域与CXCR3(IP-10、Mig和I-TAC共同受体)结合。活动性结核病患者在MTB抗原刺激后IP-10水平明显升高，在区分活动性结核病和LTBI时具有较好的敏感度，即使未经MTB特异性抗原刺激，在mRNA和蛋白水平上与LTBI相比，IP-10仍显示出与活动性结核病很强的关联性。然而，并非所有研究都表明IP-10在鉴别活动性结核病和LTBI时的性能优于IFN-γ。

白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)主要由抗原激活的T细胞产生，但也由自然杀伤细胞和树突细胞产生。IL-2是适应性免疫活性的主要成分。抗原与T细胞受体结合后刺激IL-2分泌和IL-2受体表达，IL-2受体连接激活JAK/STAT通路，致T细胞生长、增殖、分化为效应T细胞和记忆T细胞。虽然一些研究显示单独应用IL-2或者IL-2联合其他细胞因子(如IL-2/IFN-γ和IL-2/VEGF/IFN-γ组合可以作为活动性结核病和LTBI鉴别的标志物，但其确切价值尚存争议。

除了IP-10和IL-2外，目前研究过的分析物超过百余种，包含白介素类(如IL-1α/β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、IL-27等)、趋化因子(如CXCL家族、CXCR家族、MIP-1α/β、MCP、RANTES、I-309等)及其他细胞因子(如TNF-α、VEGF、GM-CSF、G-CSF、MMP-9、TGF-β等)等。虽然单一或者组合应用某种分析物可作为鉴别活动性结核病的标志物，但各研究间差异较大，结论并不统一，需要进一步的前瞻性研究来确定生物标志物的最佳选择和组合，以提高在临床实践中的诊断能力。

(三)细胞亚型及功能

测量MTB特异性T细胞的表型和功能标志物，探索更加复杂的MTB特异性T细胞亚群的数目和比例可能区分不同的感染阶段。一些研究比较了MTB特异性CD4+T细胞的分化(CD27和KLRG1)、活化(HLA-DR)、归巢潜能(CCR4、CCR6、CXCR3 和 CD161)和细胞因子(IFN-γ、IL-2 和 TNF-α)的变化。与LTBI相比，CD4+T细胞亚群在活动性结核病患者中对MTB刺激发生重大变化，促进记忆成熟、活化升高和炎症潜能增加。此外，MTB特异性CD4+T细胞的功能特征似乎与它们的分化程度有内在关联，其中，MTB特异性IFN-γ+T细胞的HLA-DR和CD27表达水平均可以区分LTBI和活动性结核病，尤其是前者表现更好。CD4+T细胞的CD38和Ki67表达亦被认为可以鉴别活动性结核病与LTBI，但CCR4单独作为标志物的鉴别作用则不明确。而且，由多种细胞因子共表达定义的MTB特异性细胞比由一种细胞因子表达定义的MTB特异性细胞可能具有更好的区分活动性结核病患者和LTBI者的能力，如MTB特异性CD38+CD27-TNF-α+CD4+T细胞亚群、CD27-IFN-γ+TNF-α+CD4+T细胞亚群及CD27-CCR4+IFN-γ+CD4+T细胞亚群均可有效区分活动性肺结核与LTBI。

此外，中性粒细胞或循环单核细胞的CD64表达、CD4+中央记忆型T细胞分布及其在MTB激活后的CD154表达、单核细胞与淋巴细胞的比值、效应记忆与中央记忆Th1细胞的比值在活动性结核病与LTBI比较时均有明显差异。除了MTB刺激相关特异性的生物标志物外，有研究发现非特异性功能CD4+T细胞、非特异性功能自然杀伤细胞和CFP-10斑点数的组合应用、NKG2C+自然杀伤细胞、多形核髓源性抑制细胞也可作为区分活动性结核病和LTBI的生物标志物。

(四)基因表达与调控

1.基因表达：因MTB感染为动态进程，因此，依赖单一生物标志物来鉴别活动性结核病和LTBI可能无法获得理想效果，而多个标志物组合可能带来新的希望。如分析各种不同的血液转录特征及组合可用于结核病的诊断及鉴定。以往研究显示，标志物组合数量大小不一，最多的一项研究多达393个基因。Leong等构建了基于印度人群RNA测序数据的预测模型，定量评估了已发表的编码基因生物标志物鉴别活动性结核病和LTBI的能力。其发现来自Berry等研究的393个生物标志物组合在所有8组已知生物标志物组合中表现最好。Warsinske等开展的前瞻性研究显示，基于3个基因的mRNA表达评分模型[(GBP5+DUSP3)/2-KLF2]与LTBI进展为活动性结核病有较好相关性，且预测时间点比利用痰标本检测到细菌早6个月。此模型已经商品化，称为Xpert TB Host response，但其确切价值尚需更多研究。Petrilli等发现评估的594个炎症基因中有7个基因的表达水平能够显著区分活动性结核病和LTBI。总之，基于宿主的编码基因组合可以提供识别活动性结核病患者的潜在能力，并有可能在病原学检查阳性之前预测LTBI进展为活动性结核病的个体，但诊断组合中基因组合的数量和组成需要进一步摸索和优化，以提高诊断的准确性和可行性。

2.表达调控：感染MTB后，除了某些编码基因表达改变外，MTB与人类共同进化也有效地改变了宿主表观基因组，通过激活或抑制对病原体产生免疫反应的基因表达而在免疫调节中发挥重要作用。近些年，表观遗传因素如DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA作用在疾病发生和发展中的作用逐渐被重视。DNA甲基化已经作为肿瘤及其他疾病诊断的重要方法，但在结核病领域研究尚少。Gauba等总结了MTB感染后宿主中发生的表观遗传修饰及其靶点如核心组蛋白H3精氨酸(H3R42)非尾端的二甲基化、腺嘌呤甲基化形成 N6-甲基腺嘌呤、IFN-γ引发的组蛋白H3和H4乙酰化、组蛋白乙酰化和去乙酰化等，以及与临床表型相关的结核病患者的表观遗传修饰如TLR2启动子区域的异常甲基化、PARP9和miR505 低甲基化、RASGRP4高甲基化和RPTOR下调、CpG-15/-17低甲基化和CpG18高甲基化、H3K14 低乙酰化、H3K27me3高甲基化等。但这些修饰对于鉴别LTBI和活动性结核病的价值并未进行更加深入的探索。Du等利用甲基化芯片分析最终发展为活动性结核病的LTBI者和同等数量的仍保持健康的LTBI者的全基因组DNA甲基化水平，其中8个差异甲基化(dmCpG)位点被确定与活动性结核病发生相关。这些研究提示表观遗传调节在鉴别活动性结核病和LTBI的潜在价值。

microRNA(miRs)是一类长度约为22 nt的非编码小分子RNA，通过调节mRNA的稳定性和翻译从而对蛋白质的生物活性产生影响。基于miRs的差异表达，特定的miRs已被初步确定为潜在的鉴别LTBI和活动性结核病的生物标志物。Wang等使用miRs芯片鉴定出17个差异表达miRs，其中12个在活动性结核病上调。但由于使用的芯片方法的局限性，可能导致一些未知的miRs被漏掉。Looney等发现miRs和甲基化共同调节巨噬细胞反应过程，包括免疫细胞激活、巨噬细胞代谢和AMPK通路信号传导。除miRs外，核仁小RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)及与Piwi蛋白相作用的RNA(PIWI-interacting RNA，piRNA)也可能作为MTB感染各个阶段的生物标志物和发病因素。de Araujo等测量了MTB感染不同阶段患者血液样本中4种主要类型的小非编码RNA的表达变化，除了miRs(已知在活动性结核病患者的血细胞中表达上调)外，snoRNA和piRNA在活动性结核病和LTBI中的表达都发生了很大变化。

(五)抗体与补体

体液免疫对MTB感染的免疫保护作用仍不明晰。尽管我国在临床上广泛使用抗体作为活动性结核病辅助诊断方法，但世界卫生组织并不推荐使用。最近的一些研究表明，特定抗体和B细胞反应与不同的MTB感染阶段有关，并且在活动性结核病和LTBI个体之间观察到不同的抗体特征。如LTBI与独特的抗体Fc片段功能特征、FcγRⅢ的选择性结合和不同的抗体糖基化模式有关。IgG-Fc上发现的二半乳糖聚糖结构可将LTBI与活动性结核病鉴别开来。此外，MTB特异性IgG4在活动性结核病中升高，但在治疗后明显降低。另一项多中心研究评估了57种MTB抗原的特异性抗体(单独或联合使用)用于诊断活动性结核病患者，但特异度均较差。因此，开展更多的整合MTB特异性抗体的表型和功能的研究来改善此类检测方法的诊断性能非常必要。Lubbers等研究了补体成分C1q作为血清生物标志物检测活动性结核病的价值。与4个国家的独立队列中的 LTBI 相比，活动性结核病患者的C1q水平明显升高。

(六)循环细胞游离DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)

除了以上基于宿主的生物标志物外，基于病原的标志物如痕量cfDNA也可能作为一种候选。cfDNA指在血液和其他体液中的非细胞成分中发现的核酸片段。这些核酸被认为来源于濒临死亡的人类细胞和微生物，当它们分解时，这些细胞和微生物会将其内容物释放到血液中。cfDNA比基因组DNA小得多，平均大小为170bp。大多数研究聚焦于其作为诊断活动性结核病的效能，有少数研究试图探究其用于区分活动性结核病和LTBI的应用。一项研究将活动性结核病密切接触者和经IGRA确认的LTBI作为对照组，发现其中大多数LTBI者的cfDNA显示阴性，但其中2例与结核病患者接触的LTBI者的IS6110 cfDNA检测呈阳性(Ct cutoff值为38.2)，推测2例LTBI者在登记时可能处于极早期结核病阶段。这2例LTBI者接受了抗结核预防性治疗。然而，他们在随访期间并没有发展为活动性结核病。需要进一步的研究来评估LTBI状态对MTB cfDNA检测性能的影响；推测认为cfDNA阳性者的抗原呈递细胞比cfDNA阴性者更加容易诱导MTB特异性适应性免疫反应，从而将cfDNA释放到体液中。通过定量cfDNA的浓度变化可能检测到目前无法用传统微生物学方法识别的疾病，从细胞和组织水平评价宿主对感染的反应 (假设用于cfDNA检测技术有足够高的敏感度)。

三、问题与展望

尽管TST和IGRA已经在学生及免疫抑制等特殊人群广泛用于LTBI筛查，并在临床用于活动性结核病的辅助诊断，但其在鉴别活动性结核病和LTBI方面价值有限。随着对于MTB与人体免疫系统互相作用机制认识的不断深入，基于MTB感染特异性的新型标志物成为改善鉴别诊断的潜在目标。但既往研究仍然存在着一些需要解决的问题。

首先，各研究之间的生物标志物选择及效能重复性较差，主要源于研究设计的差异、不同的宿主遗传背景、病原体谱系、感染时间、结核病的部位和持续时间，以及分析方法的技术差异等。因此，需要在代表现实世界的多样化、异质性的感染者和独立队列，不同的地理环境(不同的宿主遗传背景和循环病原体谱系)，不同免疫水平的人群中验证目标生物标志物。

其次，以往用于探索鉴别LTBI和活动性结核病生物标志物的研究中，研究对象纳入的是经TST 或IGRA判定的LTBI者及经培养等病原学方法确认的活动性结核病患者，但由于LTBI的诊断缺乏金标准，而基于现有敏感度有限的病原学方法的结核病确诊患者也不能代表活动性疾病发展的早期阶段，因此，基于这个前提对LTBI和活动性结核病生物标志物的研究也并不能完全解释整个感染的疾病进程，尤其是在由LTBI向活动性结核病进展的最早期阶段。评估阳性预测值的前瞻性纵向队列研究是可能比较LTBI检测性能的最佳方法。目前，我国LTBI的预防性治疗尚处于起步阶段，建议我国建立完整的大人群随访队列，针对生物标志物寻找和验证的研究可以整合入此队列，探索并确立各个感染阶段甚至是治疗后的相关生物标志物。

再次，考虑到MTB与人类宿主之间相互作用的异质性，生物标志物需要在此动态变化中能够定义特定位置或时段，因此，针对不同靶标，采用高通量技术可以更加全面地揭示宿主反应的不同方面，通过组合来自各个维度的标志物，获得更深入的生物学解释和更准确的鉴别诊断方法。当然，此类生物标志物的实用性还高度依赖于将科研转化为临床实践可用的技术或平台，以允许在真正需要鉴别诊断的患者就诊环境中进行应用。

鉴于我国MTB流行菌株主要为L2家系，与欧美国家不同，因此，宿主产生的免疫反应也不会完全相同。我国相关科研、医疗机构及主管单位、学者、企业应共同参与研究和转化，发挥各自所长和优势，探索出适合我国应用的鉴别LTBI和活动性结核病的生物标志物和技术。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献  夏辉：酝酿和设计实验、起草文章、对文章的知识性内容作批评性审阅、指导；王瑞白：对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费；赵雁林：分析/解释数据、对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费

参考文献略

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编辑：杨  颖   

审校：郭  萌

发布日期：2023-03-14