本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及一种用于预测桃树流胶病抗性的kasp分子标记及其应用。

背景技术：

1、桃(prunus persica(l.)batsch)属蔷薇科(rosaceae)李属(prunus)，是我国重要经济果树之一，目前全国各地均有栽植。桃树流胶病是桃树栽培过程中常见病害，多见于高温高湿气候地区，发病特征主要为在树体出现胶状物质，发病程度越重胶体覆盖面积越大。流胶病会导致树势衰弱，降低桃树产量，从而造成巨大经济损失，如何有效防治流胶病是桃树生产栽培上所面临的重大问题。目前生产上对流胶病基本是放任，少量的防治主要依赖于化学或生物防治，发掘高抗种质资源与培育抗病新品种是减少桃树流胶病的根本措施。

2、分子标记辅助育种利用与目标性状紧密连锁的分子标记筛选优异基因型，从而提高育种效率，加速育种进程。目前，已有一系列桃重要性状相关的分子标记得到开发，包括果皮(有毛/无毛)、果形(扁平/圆形)、肉质(硬质/非硬质)、果肉颜色(红肉/白肉/黄肉)等品质性状(杨英军，张开春，李荣旗，等.桃果实有毛/无毛，白肉/黄肉性状的rapd分子标记[j].华北农学报，2000，15(003)：6-9.)，抗蚜虫、抗根结线虫等抗病性状(孟君仁，曾文芳，邓丽，等.桃若干重要性状的kasp分子标记开发与应用[j].中国农业科学，2021.)，花型(铃型/蔷薇型)等形态性状(吉爽秋，王力荣，李勇，等.桃花花型(铃形/蔷薇形)基因型鉴定，分子标记开发与利用[j].果树学报，2023，40(3)：422-431.)。而流胶病抗性相关分子标记的研究则鲜有报道。

3、随着桃全基因组测序完成，遗传连锁定位技术与全基因组关联分析也成为挖掘目的基因、开发分子标记的重要手段，daniel(mancero-castillo d，beckman t g，harmon pf，et al.a major locus for resistance to botryosphaeria dothidea inprunus.tree genetics&genomes，2018，14(2)：26.2018)通过构建杂交群体及遗传作图分析发现1个来源于扁桃的显性抗性基因，将其定位于桃的第6-8嵌合连锁群区域；甘可欣(2021)通过重测序bsa关联分析得到一系列桃流胶病关联snp位点；li(2022)利用重测序gwas关联分析结合rna-seq，鉴定到5个流胶病抗性相关显著snp位点及4个候选基因。伴随测序技术的发展，竞争性等位基因特异性pcr标记(kompetitive allele specific pcr，kasp)由于其高通量、低成本的特点被应用于分子辅助育种，其利用竞争性等位基因特异性，对特异位点上的单核苷酸多态性(snps)和插入/缺失(indels)进行基因分型。利用上述抗性相关snp位点开发与桃流胶病关联的kasp标记，可以利用标记快速有效地筛选出高抗品种，为桃分子标记辅助种及培育抗病新品种提供理论依据。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于预测桃树流胶病抗性的kasp分子标记，该kasp分子标记分别位于桃的第1、2、4和6条连锁群上，与桃的流胶病的发病率有显著相关性，具有良好的多态性，利用该kasp分子标记及kasp分子标记引物组合对不同桃品种或品系进行抗流胶病检测，准确率高，利于提高桃树的育种效率，加快实现高温高湿地区桃树抗流胶病新品种的选育。

2、为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：

3、一种用于预测桃树流胶病抗性的kasp分子标记，所述kasp分子标记为以下至少一种：

4、(1)pp01_37618213；(2)pp02_13386543；(3)pp04_25252602；(4)pp06_27085141；

5、其中，pp01_37618213位点为1号染色体第37618213位，该位点的碱基为t或c；定位pp01_37618213的等位基因t和c为seq id no.13所示序列的第101位碱基；

6、pp02_13386543位点为2号染色体第13386543位，该位点的碱基为t或c；定位pp02_13386543的等位基因t和c为seq id no.14所示序列的第101位碱基；

7、pp04_25252602位点为4号染色体第25252602位，该位点的碱基为t或c；定位pp04_25252602的等位基因t和c为seq id no.15所示序列的第101位碱基；

8、pp06_27085141位点为6号染色体第27085141位，该位点的碱基为t或c，定位pp06_27085141的等位基因t和c为seq id no.16所示序列的第101位碱基；。

9、本发明还提供了所述用于预测桃树流胶病抗性的kasp分子标记在桃树品种或品系选育中的应用。

10、本发明还提供了一种用于预测桃树流胶病抗性的kasp分子标记引物组合，针对pp01_37618213位点的引物对：

11、正向fam引物序列如seq id no.1所示，所述正向hex引物序列如seq id no.2所示，所述通用反向引物序列如seq id no.3所示；

12、针对pp02_13386543位点的引物对：

13、所述正向fam引物序列如seq id no.4所示，所述正向hex引物序列如seq id no.5所示，所述通用反向引物序列如seq id no.6所示；

14、针对pp04_25252602位点的引物对：

15、所述正向fam引物序列如seq id no.7所示，所述正向hex引物序列如seq id no.8所示，所述通用反向引物序列如seq id no.9所示；

16、针对pp06_27085141位点的引物对：

17、所述正向fam引物序列如seq id no.10所示，所述正向hex引物序列如seq idno.11所示，所述通用反向引物序列如seq id no.12所示；

18、其中，正向fam引物的5’端连接荧光标记fam，正向hex引物的5’端连接荧光标记hex。

19、本发明还提供了一种用于预测桃树流胶病抗性的试剂盒，包括所述的kasp分子标记引物组合。

20、本发明还提供了一种预测桃树流胶病抗性的方法，包括以下步骤：

21、(1)提取待测桃组织的基因组dna；

22、(2)以所述基因组dna为模板，利用所述的kasp分子标记引物组合分别对pp01_37618213位点、pp02_13386543位点、pp04_25252602位点、pp06_27085141位点进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；

23、(3)对所述pcr扩增产物进行基因分型，分别获得pp01_37618213位点、pp02_13386543位点、pp04_25252602位点和pp06_27085141位点的基因型；

24、若检测待测桃品种基因组的pp01_37618213位点基因型为tt，为高抗桃品种，若pp01_37618213位点基因型为ct或tt，为低抗桃品种；若检测待测桃品种基因组的pp02_13386543位点基因型为cc，高抗桃品种，若pp02_133865433位点基因型为ct或tt，为低抗桃品种；若检测待测桃品种基因组的pp04_25252602位点基因型为tt，为高抗桃品种，若pp04_25252602位点基因型为cc，为低抗桃品种；若检测待测桃品种基因组的pp06_27085141位点基因型为cc，高抗桃品种，若pp06_27085141位点基因型为tt，为低抗桃品种；高抗桃品种的桃树流胶病发病率显著低于低抗桃品种。

25、进一步地，步骤(3)中，pp01_37618213位点基因型为ct与pp04_25252602位点基因型为tt共同形成基因组合时，则为低抗桃品种；pp04_25252602位点基因型为cc与pp06_27085141位点基因型为tt共同形成基因组合时，则为高抗桃品种。

26、利用得到的减效基因型与增效基因型，分析不同基因型组合对流胶病抗性的表型效应，筛选出评价高抗材料的最佳基因型组合pp04_25252602+pp06_27085141-c/c+t/t，选择率达82.76％，以及筛选出评价低抗材料的最佳基因型组合pp01_37618213+pp04_25252602-c/t+t/t，选择率达92.86％。

27、具体的，步骤(2)中，94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃延伸60s，每个循环延伸温度降低0.6℃，共循环10次；94℃变性20s，55℃延伸60s，循环26次。

28、若26个循环后信号值仍较低，分群不分散但有分群趋势时，选择加循环反应后进行荧光读取，选择加循环反应后进行荧光读取；加循环反应：94℃变性20s，57℃延伸60s，循环3次。

29、本发明的有益效果：本发明首次开发了4个桃流胶病抗性关联kasp分子标记及其引物组合，结合表型数据对其进行验证和评价，并利用kasp标记及其引物组合对510份桃品种进行分型，提高了桃种质抗性鉴定效率，为分子标记辅助育种提供理论和技术支持。