研究细菌基因功能的方法主要有基因敲除(基因组中直接去除某基因, 位点特异)、反义RNA干扰(降低mRNA表达量, 影响因素多)、转座子插入突变(插入位点随机, 筛选繁琐, 存在多位点插入突变)、基因过表达等技术, 但最可靠而常用的方法仍是基因敲除[1, 2], 即选择合适的质粒, 将靶基因两侧的同源序列克隆至载体上, 转入宿主菌后通过同源重组实现对靶基因的置换敲除。由于微生物的多样性, 将外源DNA导入宿主菌并完成同源重组的策略也千差万别。目前, 未见有适合于多种宿主菌基因敲除的通用重组系统的报道。因此, 需要根据宿主菌的特点来构建相对特异的基因敲除系统, 用于基因功能研究。

葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)是引起医院内感染的重要病原菌[3, 4, 5], 由于其GC含量较低(mol%约28%~35%), 通过同源重组进行基因敲除相对较困难, 常常受限于转化效率低、重组频率低、突变株筛选繁琐等困难, 是葡萄球菌致病基因功能研究的难点。随着分子生物学技术的发展, 用于葡萄球菌基因敲除的重组系统也得到不断改进, 基因敲除的过程也变得简捷。作者结合本实验工作, 对葡萄球菌基因敲除中采用的以质粒为基础的同源重组技术进行如下综述。

将目的基因(待敲除的靶基因)两侧的同源序列(分别称为同源臂A/B)克隆至复制起始子缺陷的质粒中, 一般在两段同源臂之间含有一段抗性基因(图1A)。在非容纳条件下, 质粒通过同源重组整合至细菌基因组中(图1B)。在容纳条件下, 通过质粒的滚环复制发生单交换和双交换, 单交换重组时形成含有野生型和突变型同源序列的部分二倍体细胞, 靶基因敲除不成功。双交换重组时, 随着质粒的切除, 要么突变型同源序列留在细菌基因组中, 带有野生型的质粒被切除, 靶基因敲除成功(图1C-1); 或者野生型序列留在细菌基因组中, 同源重组质粒切除, 靶基因敲除不成功(图1C-2)。在大多数菌株中, 同源重组是一个低概率事件, 所以需要插入抗性标记帮助筛选突变株。除非是重组质粒携带反向选择标记, 否则质粒切除或丢失发生的概率都非常低, 需要大量精力来筛选突变株[6, 7]。

由于质粒DNA与宿主菌基因组的整合是随机的, 发生整合的效率可高可低, 所以对克隆载体的选择非常重要。Reinhold等[8]利用温度敏感型质粒pTV1Ts(40 ℃质粒消除成功率高, pE194质粒来源)构建同源重组质粒, 用于肉葡萄球菌(S. carnosus)和木糖葡萄球菌(S. xylosus)基因敲除的研究。将pTV1Ts 质粒来源的BamHI-PstI酶切片段(4.0 kb)与pBR322质粒来源于的BamHI-PvuII酶切片段(2.7 kb)连接形成pBT1质粒, 前一片段含有质粒pE194的复制子和pC194的氯霉素乙酰基转移酶基因(cat194), 后一片段含有内酰胺酶基因和质粒ColE1复制起始子。pBT1质粒获得大肠杆菌和葡萄球菌的复制能力, 在大肠杆菌内表现为氨苄青霉素抗性(cat194表达相对较低, 不推荐使用氯霉素抗性标记), 葡萄球菌内氯霉素抗性(在亚抑菌浓度作用下葡萄球菌转化子的涂板阳性率可提高约3倍)。再将pUC18来源的HindIII-BglI片段连接入pBT1, 得到含有多克隆位点(12个酶切位点)的pBT2质粒, 多克隆位点位于转录终止子T1附近。pBT2质粒在大肠杆菌和葡萄球菌中结构较稳定, 30 ℃条件下能稳定存在, 40 ℃以上容易丢失, 比较适合于葡萄球菌靶基因的突变研究。

Reinhold等[8]用pBT2质粒敲除肉葡萄球菌磷酸转移酶系统(phosphotransferase system, PTS)基因ptsI, 为方便突变株的筛选, 作者在同源臂构建过程中引入了红霉素抗性基因(ermB)。PCR分别扩增ptsI基因两侧大约1 kb片段(上/下游同源臂), 与pEC7质粒来源的EcoRI-PstI酶切片段(含ermB)克隆连接至pBT2质粒, 形成的重组质粒pBTIE1转入肉葡萄球菌, 30 ℃条件下, 氯霉素(Cm 20 g/mL)敏感, 红霉素(Erm 10 g/mL)耐药, 并且不能分解甘露醇和果糖的菌株为疑似突变株。经过Southern Blot验证ptsI基因被敲除, 并且证实基因组上没有质粒的序列。获得突变株菌落的比例约8%~12%(个体试验差别大)。另外, 又用pBT2质粒敲除木糖葡萄球菌的蔗糖酶基因scrB, 不同的是上/下游同源臂大小分别为1.7 kb和2 kb, 基因敲除效率42%~57%。Egeter等[9]用pBT2质粒敲除葡萄球菌的其它基因, 发现敲除效率从1%~50%不等。

pBT2不仅可以用于肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌的基因敲除, 也可以用于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。本实验室[10, 11]用pBT2成功敲除表皮葡萄球菌双组分系统lytSR和arlRS。PCR扩增lytSR和(或)arlRS上/下游同源臂(lytSR同源臂约1.8 kb, arlRS同源臂约0.9 kb~1.2 kb), 克隆形成pBT2-△ lytSR/△ arlRS重组质粒, 重组质粒经金黄色葡萄球菌RN4220限制性修饰后转入表皮葡萄球菌SE1457。30 ℃培养(BM培养基, Erm 10~20 g/mL)至稳定期末, 1∶ 100转接(BM, Erm 2.5 g/mL), 42 ℃培养过夜, 再经多次转接后(BM, 无抗生素)取适量涂板, 红霉素耐药(2.5 g/mL)和氯霉素敏感(10 g/mL)的克隆为疑似突变株。疑似突变株经PCR、RT-PCR及测序鉴定敲除成功。该方法筛选工作繁琐, 敲除效率比上述文献报道的明显偏低, 往往需要几个月的筛选才能得到突变株。

一般敲除突变株的筛选是通过同源重组将质粒上的抗性基因与宿主菌基因组中的靶基因进行置换, 使宿主菌在缺失靶基因的同时获得抗性基因, 通过抗性标记直接筛选疑似突变株, 这种方法称为正向选择或阳性选择(positive selection)[12]。但由于同源重组的概率非常低, 发生单交换的质粒从基因组中切除较困难, 给筛选工作带来巨大的麻烦。Tamura等[13, 14]首先使用反向选择(counter-selection)来筛选疑似突变株, 如将与蔗糖(sacB)或谷氨酰胺代谢相关的基因(glnQ)克隆至重组质粒中, 重组质粒切除不成功的菌株在适当底物作用下高表达sacB或glnQ基因, 导致毒性代谢产物堆积而生长抑制, 平板上不能形成克隆, 重组质粒与菌株基因组进行二次交换, 成功敲除靶基因的菌株生长不受影响而更容易被筛选出来。但由于葡萄球菌基因组中含有与蔗糖和谷氨酰胺代谢相关的基因, 不能通过基因sacB或glnQ的表达来反向选择。

Arnaud等[15]成功构建了可通过反向选择来敲除葡萄球菌靶基因的重组质粒pMAD。首先, 用限制性内切酶ClaI将质粒pE194ts(pE194来源, 温度敏感型复制起始子)线性化, 克隆至质粒pBR322中, 形成穿梭质粒pE194ts:pBR322。在NruI和EcoRV之间插入3个PCR片段:1)从质粒pMTL22来源的多克隆位点, NaeI和BglII的酶切片段; 2)以金黄色葡萄球菌(S. aureus RN6390)基因组为模板, PCR扩增clpB基因(编码Clp-Hsp100 ATP酶)的启动子区, 并加上BglII和BamHI酶切位点; 3)嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)不含启动子区的bgaB基因(编码耐热半乳糖苷酶), BamHI和StuI的酶切片段。上述3个片段连接入质粒pE194ts:pBR322, 获得重组质粒pMAD(G-菌中氨苄青霉素抗性, G+菌中红霉素抗性)。pMAD质粒带有pE194ts复制起始子(温度敏感性)和bgaB基因, 通过clpP启动子(pclpB), 编码耐热的半乳糖苷酶, 在含X-gal平板上形成蓝色菌落。这技术本身并不能影响同源重组的频率, 但对于质粒丢失或从基因组中切除菌株的筛选非常有利。

Arnaud等[15]利用pMAD敲除金黄色葡萄球菌vraFG基因。PCR扩增vraFG上/下游同源臂(约0.6 kb和0.9 kb), 壮观霉素耐药基因spc(1.3 kb, pIC333质粒来源), 重组PCR将3个PCR片段克隆至pMAD, 构成重组质粒pMAD△ FG, 经鉴定后电击转入金黄色葡萄球菌(S. aureus Mu3)。从TSA平板(含X-gal)上挑取1个蓝色菌落转接于无抗性TSB培养基, 30 ℃震荡培养2 h后变温至42 ℃继续培养6 h, 取适量涂板于TSA(含X-gal和抗生素), 42 ℃过夜培养。壮观霉素(100 g/mL)耐药、红霉素(5 g/mL)敏感的白色菌落即为vraFG疑似突变株。据统计, 1%~5%白色菌落为敲除突变株, 还有大量的淡蓝色菌落, 可能由于单交换重组后质粒DNA与宿主菌基因组整合形成。作者还用pMAD敲除金黄色葡萄球菌sarA、sigB基因。

本实验室[16, 17]用pMAD质粒敲出表皮葡萄球菌SE1457双组分系统saeRS。PCR扩增saeRS上/下游同源臂(约1.0 kb和1.3 kb), 同源臂间连接壮观霉素耐药基因spc, 酶切片段克隆至pMAD载体中, 构建重组质粒pMAD△ saeRS, 转入宿主菌SE1457中。挑取蓝色单菌落于BM培养基(Spc 50 g/mL), 43.5 ℃震荡培养24 h, 取适量菌液涂于BM平板(含X-gal及抗生素), 43.5 ℃培养过夜, 壮观霉素耐药, 红霉素敏感的无色菌落即为敲除突变株; 涂板同时, 转种于新鲜BM培养基, 相同条件下继续震荡培养, 直至筛选出突变株为止。该技术通过蓝白斑筛选, 大大降低筛选的工作量, 通常也需要1~2月可获得突变株。

pMAD质粒还可用于一些G+菌的基因敲除, 如单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)等[18, 19], 但由于pE194来源的复制起始子在链球菌、肠球菌、乳球菌中不工作, 限制了该质粒的应用。

pMAD质粒的使用, 通过颜色反应更容易实现同源重组突变株的筛选, 但该质粒对重组概率及突变株筛选均无直接影响[15]。SecY是一种膜蛋白, 属于SecYEG转位酶家族中的成分之一, 能将含有前体蛋白的信号肽通过细胞膜转移至细胞外, 与细胞蛋白的分泌密切相关, SecY的表达是细菌生长所必需的[20, 21]。因此, 通过secY反义RNA的表达能够抑制平板上菌落的形成。pKOR1重组质粒就是利用secY反义RNA的表达来实现对敲除突变株的反向选择, 大大地提高了同源重组的概率和突变株筛选的效率[21]。

为构建secY反义RNA基因盒, 通过PCR从金黄色葡萄球菌RN4220基因组中扩增含有核糖体结合位点的secY基因(570 bp), PCR产物经SmaI酶切后反向插入pYJ335质粒中Pxyl/tetO启动子的下游, 形成重组质粒p335Y-R, 并将p335Y-R电击转入RN4220后, 在脱水四环素(ATc)诱导作用下, 平板上无克隆形成证实该质粒中secY反义RNA能正常工作[22]。

PCR扩增p335Y-R质粒中反义secY基因盒, 酶切后连接入pTS1质粒, 形成pTS1-HF质粒(含四环素抗性基因tetR, 同时含有与复制基因rep转录相反的secY基因)。PCR扩增pDONR221质粒(Invitrogen)噬菌体基因盒, 经T4 DNA聚合酶和多聚核苷酸激酶处理后插入pTS1-HF质粒(破坏了抗性标记cat基因), 形成pHF-ccd质粒。PCR扩增pC194质粒中的cat基因, 克隆至pHF-ccd质粒, 形成重组质粒pKOR1。

pKOR1质粒具有噬菌体基因盒(Gateway technology, Invitrogen), 不需要限制性内切酶和连接酶即能实现同源序列的快速克隆。重组盒子有2个关键成分(attP位点和ccdB位点)。在噬菌体整合酶和大肠杆菌整合宿主因子(E. coli integration host factor, IHF)的作用下, attP序列能与DNA插入序列上的attB序列进行重组, 形成新的重组质粒。ccdB基因编码大肠杆菌解旋酶抑制剂, 当DNA片段与pKOR1整合后, 重组形成的pKOR1质粒丢失ccdB基因, 重组子生长不受影响而大量增殖; 整合不成功的pKOR1质粒, 通过ccdB基因的表达生长受到抑制, 简化了重组质粒pKOR1的构建。

Bae等[22]在不使用抗性标记的条件下, 用pKOR1质粒对金黄色葡萄球菌(S. aureus Newman)rocA进行框内敲除(in-frame deletion, 即基因敲除范围限于开放读码框内)。PCR分别扩增(引物5'端加上attB序列)金黄色葡萄球菌rocA基因上/下游同源臂(约1.0 kb), 同源臂片段间通过SacII连接后直接与pKOR1质粒进行重组(BP ClonaseTM enzyme mix, Invitrogen), 获得重组质粒pKOR1-△ rocA, 电击转化入金黄色葡萄球菌中, 得到菌株NM(pKOR1-△ rocA)。菌株NM(pKOR1-△ rocA)过夜培养物1∶ 1 000接种于预热TSB(Cm 10 g/mL), 43 ℃(非容许温度, 质粒DNA整合至宿主菌基因组中)震荡培养过夜, 取适量划线接种于TSA(预热, Cm 7.5 g/mL), 43 ℃培养过夜。挑取1个菌落接种于TSB(含Cm 10 g/mL), 30 ℃培养过夜。取适量菌液稀释(10-4)后分别涂于不同脱水四环素浓度TSA平板(ATc=0, 1, 2 g/mL), 30 ℃培养2 d。在不含ATc的TSA平板上有大量的菌落形成, 在ATc为2 g/mL TSA平板上无菌落形成(可能是葡萄球菌的最低抑菌浓度), 1 g/mL TSA平板上约1%的细胞形成菌落, 菌落大小不一, 提示1 g/mL ATc是诱导反义secY RNA表达, 选择pKOR1质粒缺失菌株的最佳浓度。随机挑选10个疑似突变株, 经PCR验证8株成功敲除rocA基因(获得突变株效率80%)。作者比较了传统pTS1质粒和pKOR1质粒在金黄色葡萄球菌prsA基因敲除中的效率, 前者介导的同源重组中, 累积7000个单交换整合的菌株中均未筛选出prsA突变株; 后者介导同源重组概率约4%, 进一步提示pKOR1是葡萄球菌同源重组敲除靶基因效率较高的质粒。

本实验室[23, 24, 25]利用pKOR1成功敲除表皮葡萄球菌(SE1457)呼吸相关双组分系统srrAB、万古霉素耐药相关双组分系统vraSR、磷酸盐代谢调节子phoU以及聚集生物膜形成调节子abfR基因等, 敲除效率约30%~80%。此外, 还用pKOR1成功敲除金黄色葡萄球菌临床株(SA75)附属基因调节子agr[26]。一般1~2周可获得敲除突变株。

利用同源重组技术进行基因敲除是研究单基因功能的理想方法, 该技术在G-杆菌中应用非常广泛, 如大肠杆菌中噬菌体Red同源重组系统, 该系统所需同源臂小(40~60 bp), 可以直接设计在引物上, 重组效率高。葡萄球菌是常见的G+球菌代表, 由于细胞结构及胞内酶系统的差异, 导致基因敲除效率较G-杆菌困难。本室常采用以质粒为基础的同源重组技术来敲除葡萄球菌的致病基因, 不同实验者或同一实验者敲除不同的靶基因, 敲除效率差别很大。据报道, 宿主菌的生长时相, 培养基的类型, 筛选温度及同源臂大小等因素均可影响敲除效率, 但尚不清楚敲除效率与上述因素的直接量效关系。通常情况下, 选择TSB或BM培养基; 常规细菌培养选择37 ℃, 质粒DNA整合入宿主基因组温度为42 ℃~43 ℃, 质粒切除或丢失温度为30 ℃; 同源臂大小约1 kb左右(0.3~2.0 kb)。早期使用pBT2质粒进行同源重组, 通过抗性基因正向选择突变株, pMAD引入显色系统, 通过反向选择, 更容易筛选突变株, 亦可加入抗性标记; pKOR1质粒用于同源重组, 克隆构建便捷, 并通过secY反义RNA的表达来反向筛选突变株, 敲除效率最高, 且不需引入抗性基因, 不改变宿主菌遗传背景, 是葡萄球菌基因敲除的理想选择。

利益冲突:无

引用本文格式:武有聪, 孟媛媛, 丁百兴, 等.以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用[J].中国人兽共患病学报, 2019, 35(7):580-586. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.69

The authors have declared that no competing interests exist.