基因敲除 - 概述

基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和RNAi技术，它们同样可以达到基因敲除的目的

基因敲除 - 介绍

基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。

这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。现在基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。

简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。举一个简单的例子:比如有一段"序列":"1234567890"(原基因),敲除后为:"123 7890",一般一个敲除载体还会在其中插入一段外源基因,如"ABC",则新的基因为:"123ABC7890"；或者不插入基因直接连接，则为“1237890”。

基因敲除 - 基本步骤

ａ．ES细胞的获得：现在基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最近来自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。c57BL／6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学领域，并以此为背景建立了许多成功的转基因模型。

ｂ．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，此重组载体即为打靶载体。因基因打靶的目的不同，此载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体。

如为了把某一外源基因引入染色体DNA的某一位点上，这种情况下应设计的插入型载体要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及标记基因等部分。如为了使某一基因失去其生理功能，这时所要设计的替换型打靶载体，应包括含有此靶基因的启动子及第一外显子的DNA片段及标记基因等诸成分。

ｃ．将基因打靶载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞(EScell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。

ｄ．用选择性培养基筛选已击中的细胞：一般地，筛选使用正、负选择法，比如用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植人假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠。

ｅ．通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

基因敲除 - 缺陷

随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括：一方面，许多基因在功能上是冗余的， 敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能；另一方面对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。

基因敲除 - 应用

基因敲除的应用领域主要有：

1、 建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料

基因敲除小鼠是研究疾病的发生机理、分子基础及诊断治疗的重要实验材料。如1989年囊性纤维化病（CF）的致病基因（CFTR）被成功地克隆，1992年成功建立了CFTR基因的基因敲除的CF小鼠模型，为CF基因治疗提供了很好的动物模型，得以顺利通过了通过了基因治疗的动物试验，于1993年开始临床试验并获得成功。

2、 改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学

深入研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命各期的表现，可以得到详细的有关该基因在生长发育中的作用，为研究基因的功能和生物效应提供模式。例如，目前人类基因组研究多由新基因序列的筛选检测入手，进而用基因敲除法在小鼠上观察该基因缺失引起的表型变化。目前已报道了多种学习、记忆以及LTP、LTD 有缺陷的基因敲除动物，发现多种基因在学习、记忆的形成过程中必不可少。

3、 治疗遗传病。

这包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗的目的。

4、 改造生物、培育新的生物品种

细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。这项新技术在基础理论研究及实际应用中都将有着广阔的应用前景。

基因敲除技术在国外已是成熟技术，国内还仅仅是刚刚开始。但是，国内已有几家单位在这一领域开展了一些工作。

例如，利用基因敲除系统，军事医学科学院杨晓研究了Smad3基因的功能﹔上海生化所李亦平成功地鉴定了3个与骨骼发育有关的新基因﹔安徽中医学院蔡钦朝等探讨了肿瘤坏死因子受体Ⅱ在郎格罕细胞迁移中的作用、CD45蛋白酪氨酸磷酸酶与小鼠表皮γδT细胞发育的关系﹔南京大学张春妮等研究了极低密度脂蛋白和中间密度脂蛋白与动脉硬化的关系﹔第二军医大学戴旭明等将小鼠胚胎干细胞中凝血因子Ⅸ(mFⅨ)基因定向敲除，为建立血友病B的转基因小鼠模型奠定了基础.