基因敲除又称基因打靶， 早在20世纪80年代末发展起来，现已成为一种常见的分子生物工程技术。通过一定的途径使基因去除或失活，基因敲除为定向改造细菌等微生物提供了重要的技术支撑。该技术克服了传统诱变方法的盲目性和偶然性，具有使改造的基因能够稳定复制等特点，因此，在对微生物领域的机制和功能研究中占有重要的一席之地。

应用于微生物的基因敲除方法概述

>>传统的同源重组基因敲除策略

利用DNA转化技术和同源序列的重组配对的原理，将外源打靶基因整合并替换靶基因，随后进行细胞传代，筛选菌株。传统的同源重组策略主要包括基于自杀载体和聚合酶链反应连接诱变的同源重组法。该技术能定点改造DNA片段，但效率较低，针对某些细菌有一定的转化难度。

>>基于噬菌体重组系统的敲除策略

基于噬菌体重组系统的敲除策略是传统同源重组策略的延伸，代表性技术有λRed重组系统和Cre-loxP重组系统。λRed重组系统基于Red系统编码的重组酶，具有独立性，耗时短，重组效率较高的特点，主要应用于结肠杆菌。相对λRed重组系统，Cre-loxP重组系统应用更为普遍。该系统由Cre重组酶和loxP位点两部分组成，具有短小专一，无痕敲除的特点。Herrmann等（2012）对该系统进行了改进，使得敲除率可达100%。该技术在微生物领域有良好的应用前景，已应用于乳酸链球菌和肺炎链球菌等等。

图1. 改进后的Cre/loxp系统用于无痕敲除原理示意图（Herrmann等，2012）

>>基于核酸内切酶的基因敲除策略-CRISPR/Cas9技术

CRIPSR/Cas9技术是由RNA指导Cas9蛋白进行的定向基因组编辑技术。该技术具有结构简单、安全性高、切点精准、可同时编辑多个基因等优点，广泛应用于不同微生物中，将微生物基因功能研究推向新的高度和方向。Reisch等（2015）发明了no-SCAR方法，能一步实现多个位点的无痕编辑（包括缺失、点突变、小片段插入等）。该方法需要构建2个质粒，包括受PTET启动子控制表达的cas9和tetR组成表达的质粒pCas9cr4和由受PTET启动子控制表达的sgRNA和受阿拉伯糖诱导启动子ParaB控制的λ-Red系统的质粒pKDsg-xxx。Ronda等（2016）基于MAGE（Multiplex Automated Genome Engineering）技术，创造了一种更为高效的CRMAGE（CRISPR/Cas9 and λ Red recombineering based MAGE technology），该方法对3个靶标的重组率高达96.5%-99.7%。

图2. no-SCAR系统用于大肠杆菌的基因组编辑（Reisch&Prather 2015）。

图3. CRMAGE系统的两个质粒结构（Ronda等 2016）。

>> 其他基因基因敲除策略

包括基于噬菌体或转座子的随机插入法，RNAi技术，以及ZFN和TALEN技术（一代和二代核酸内切酶基因编辑工具）。