蛋白酶K在新冠期间一战成名，从此走进了大众视野，然而在这之前的知名度却远不及它所发挥的作用，其实在科研研究中，蛋白酶K一直是十分重要的存在。希望本文能帮助到在科研中对蛋白酶K的使用有问题及疑惑的小伙伴们，期待共同进步！

一、蛋白酶K的贮存液浓度、常用工作浓度一般为多少？最佳PH范围是多少？干粉蛋白酶K如何配制？

·蛋白酶K贮存液的浓度一般为10 mg/mL或20 mg/mL。

·常用工作浓度为50-100 μg/mL，需根据所用缓冲液是否含有SDS、尿素、pH是否适合、温度是否适合等因素确定具体的工作浓度。常用浓度的EDTA、Triton X-100、Tween 20、Sarkosyl、盐酸胍对蛋白酶K的活力影响不大。

·最佳PH范围为7.5－8.0。

·干粉蛋白酶K配制推荐溶解缓冲液为50 mM Tris-HCl（pH7.5），10 mM CaCl2，配制时需轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解，不要涡旋混合，过滤除菌后分装成小份贮存于-20℃。

二、为什么RNA提取中需要用蛋白酶K呢？

　　因为核酸常常与蛋白质相结合，提取时，蛋白质降解不完全，核酸就无法被分离变成游离形态，那么核酸提取效率和回收量就会大大减少，从而影响实验效果。我们都知道RNA的质量对于Northem印迹及杂交分析、cDNA合成及体外翻译等实验的成败至关重要。而RNA极不稳定、易于被广泛存在的RNase（RNA酶）降解，因此利用蛋白酶K创造一个无RNase的环境、严格防止RNase污染是成功提取RNA的关键。这里提醒科研工作者选择纯化质量高，不含DNase和RNase的蛋白酶K产品，更有利于各种核酸的高效提取。经费足够的话，可以选择美国Amresco公司的0706蛋白酶K，效果不错；考虑性价比可以选择国内的Starvio蛋白酶K，因为相较于市面上蛋白酶K≥30U/mg的比活力，Starvio的比活力可达到≥35U/mg，这是非常难得的。

三、实验样本为痰液，想要提取核酸，需要用蛋白酶K处理吗？

　　推荐使用，因为痰液样本本身复杂，使用蛋白酶K处理后可以使核酸更易释放出来，继而提高核酸提取的效率。为了验证蛋白酶K在核酸提取中的作用效果，我们实验室曾进行过痰液RNA提取实验，一组用Starvio蛋白酶K处理，另一组用磷酸盐缓冲液（PBS）处理，每组设置5个样本，其它实验条件保持一致的情况下，将两组实验所提取的RNA，分别进行qPCR检测。结果显示，PBS处理法的CT值范围为33.4-38.0，而Starvio蛋白酶K处理组的CT值范围在28.1-32.3之间，相比之下，Starvio蛋白酶K处理组早了好几个循环。

        一些复杂样本如痰液、粪便等，其中往往存在着可抑制PCR反应的物质（糖蛋白、免疫球蛋白等），使用了蛋白酶K可最大程度清除该类物质；同时，这些样本中容易残留较多RNA酶，使用蛋白酶K可最大程度灭活RNA酶，防止病毒RNA的降解，提高RNA回收率，保证PCR结果准确性。

四、能否举例说明蛋白酶K加少加多了会怎么样呢？

Ø [蛋白酶K加少的影响：在DNA提取中，蛋白酶K的主要作用就是水解蛋白质的可以将蛋白质与DNA很好的分离。如果蛋白酶K的含量少的话就会影响蛋白质的水解程度，导致提出的DNA含量和纯度都会受到影响。

Ø 蛋白酶K加多的影响：蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的样品处理，它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用，能增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号。但蛋白酶K的用量过多、浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时，都会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织切片的脱落，细胞核的消失，从而影响杂交结果。

五、蛋白酶K在使用过程中要注意什么？

（1）蛋白酶K的最佳反应温度为65℃，但在65℃或更高的温度蛋白酶K自身的也非常迅速地降解，因此推荐反应温度50℃-55℃；

（2）Ca2+可以保护蛋白酶K不会自我降解、增加蛋白酶K的热稳定性、调节蛋白酶K的底物结合位点；

（3）配制好的蛋白酶K溶液分装保存于-20℃，避免反复冻融，以免酶活力下降；

（4）干粉蛋白酶K易受潮，注意密封于4℃储存保存。