原标题：Western Blot（蛋白质免疫印迹）实验常见问题及解决方法（中）

上篇咱们分享了Western blot实验结果中背景较高、无目的条带两个常见问题都还记得吗？不记得可点击《Western blot检测实验常见问题原因以及解决方法（上）》回去复习哦~那这篇们继续总结学习吧~

常见问题一、Western blot实验结果中杂带较多

原因1： 目的蛋白有多个修饰位点，如磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等，本身可以呈现多条带；

解决方法：WB实验前查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

原因2：实验检测的目的蛋白有其它剪切本；

解决方法：查阅文献或生物信息学分析可能性。

原因3：样本处理过程中目的蛋白发生降解；

解决方法：WB检测的蛋白样本加入蛋白酶抑制剂同时样本处理时在冰上操作。

原因4：上样量过高，太敏感；

解决方法：尽量减少上样量，注意观察。

原因5：一抗不纯或特异性不高；

解决方法：纯化抗体，或者重新选择或制备高特异性的抗体。

原因6：一抗或者二抗浓度偏高；

解决方法：降低一抗、二抗浓度。

常见问题二、Western blot实验结果中条带大小与理论值位置不符

原因1：Marker指示大小偏差；

解决方法：WB实验中选择合适的预染Marker，并与非预染Marker 对比，观察差异大小。

原因2：琼脂糖凝胶电泳体系影响；

解决方法：避免边缘孔的不稳定因素，在中间孔上样，边缘孔加入等量上样缓冲液平衡体系。

原因3：翻译后修饰；

解决方法：查阅文献，确认蛋白本身是否存在磷酸化或糖基化等修饰。

原因4：翻译后剪切及异构体；

解决方法：查阅文献，确认蛋白是否存在多种剪切活性形式。

原因5：蛋白多聚体形成；

解决方法：蛋白二聚体或多聚体形成，在样本制备过程中，使用新鲜的DTT或β-巯基乙醇，保持蛋白单体状态。

原因6：蛋白相对电荷变化；

解决方法：蛋白氨基酸组成不同，某些蛋白所带申荷未能被带负电的SDS所覆盖，导致蛋白迁移率与蛋白大小不成正比。

OK，Western blot实验常见问题原因以及解决方法中篇就我们就总结完咯，秃头小宝贝们学会了吗？希望能帮到在实验室埋头苦干的实验人员，想要详细学习实验操作方法的好学者们可留言问客服要视频教程观看学习哦！

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