生物屋 2024-05-27 08:31 上海

[实验概述]

提起Western blot，不禁会想到Southern blot和Northern blot。1975年，Edwin Southern教授发明了DNA杂交检测技术，故命名为Southern blot。之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授又发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blot相似，故命名为Northern。George Stark这位牛人教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测方法，1979 年 7 月 1 于《美国国家科学院院刊》(PNAS)发表论文：Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. (1979) PNAS 76:3116-3120。1981年，Neal Burnette将其命名为Western blot。

30年来， Western blot技术已成为蛋白质研究中最常用的工具。它的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相支持物上，固相支持物包括硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜。首先将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，这样固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用，最后通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。

WB的科学应用

一、检测蛋白质的不同同种异构体

选择性剪接是一个转录后过程，其中一个编码基因产生多个蛋白质亚型由于在各种生物和病理过程中具有不同的功能，蛋白质异构体可以作为生物标志物和治疗靶点。因此，特异性蛋白质异构体的检测和定量可以成为蛋白质分析领域的主要内容。western blotting有足够的潜力来检测相同蛋白质的不同异构体，且大小差异极小用单克隆用于检测异构体特异性表位的抗体可能是检测不同蛋白质异构体的有用方法。

二、检测蛋白质之间的相互作用

western印迹法是一种在体外直接检测PPIs的分子生物学方法，由标准WB法发展而来在Far - WB中，非抗体蛋白被用来探测印迹上感兴趣的蛋白。如果被染色的蛋白质与探针相互作用，斑点在膜上可见。

三、检测蛋白质- DNA相互作用

Southwestern blotting (SWB)是一种快速表征dna结合蛋白和/或tf的技术。SWB分析与传统的WB相似，除了探测步骤，其中用放射性标记的预先设计的DNA寡核苷酸探测印迹膜。在最后一步，蛋白质组学方法用于鉴定标记蛋白。

四、检测翻译后修饰

蛋白质的翻译后修饰(PTM)解释了蛋白质组的扩增和多样性。对于PTM的鉴定、验证和机理表征，建议使用多种分析方法。对于低通量PTM分析，western blot是一种合适的技术，因为它不需要专门的专业知识和工具。

该方法为研究人员提供了捕获低丰度、内源性和新型PTMs与IP结合的方法。值得注意的是，通过这种方法检测PTM时，PTM特异性抗体的选择被认为是一个挑战。

五、检测蛋白质的亚细胞定位

当蛋白质处于适当的亚细胞区室时，它们可以发挥其固有的功能蛋白质的定位和功能是相互关联的。这意味着当蛋白质改变它们的位置时，它们可能获得新的或不同的功能。

除了传统的WB，单细胞western blotting (scWestern)被认为是蛋白质亚细胞定位研究和单细胞蛋白分析的一次革命。WB有足够的潜力减轻抗体探针的交叉反应性，这是其他单细胞测定(如ICC)的主要缺点。在scWestern中，特异性和选择性的western印迹已被引入单细胞蛋白分析蛋白质测定可以被认为是一种高通量技术，其中微设备上的聚丙烯酰胺(PA)微孔阵列支持数千个并发单细胞western blots每次运行scWestern包括五个步骤：细胞裂解，电泳和蛋白质分离，蛋白质跳跃，免疫探测和成像。

六、抗体开发和鉴定、表位定位

特异性是WB的主要特点，这使得它在其他低通量的表位定位技术中成为一种强大的方法。通常，将相同数量的不同大小的所需抗原片段印迹到膜上，然后加入特异性抗体，特异的表位通过酶标二抗检测。

[实验原理]

Western blot是一种常用于研究中分离和鉴定蛋白质的技术，它利用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)来分离指定样品中包含的各种蛋白质，然后将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF 膜上，接下来将膜与对感目标蛋白质的特异抗体一起孵育。在洗膜过程中，未结合的抗体被洗掉，只留下与目标蛋白质结合的抗体，最后通过显影胶片或荧光扫描来检测结合的抗体。

由于抗体仅与目标蛋白质结合，因此一般只能看到一条清晰的带，条带的粗细对应于蛋白质量。通过分析特定反应的位置和强度，可以获得目标蛋白在给定细胞或组织匀浆中的表达信息。由于凝胶电泳的高分辨率和免疫的强特异性和高灵敏度，Western印迹分析可检测低至1ng的靶蛋白，该方法广泛应用于分子生物学、生物化学、免疫遗传学等分子生物学领域。

依其原理，可分为两种方法：A、直接法和B、间接法。

两种的方法的优缺点比较

[实验材料]

蛋白质样品；

丙烯酰胺、SDS、Tris-HCl、β-巯基乙醇或DTT、甘氨酸、Tris、甲醇、PBS、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、ddH2O、考马斯亮兰、乙酸、脱脂奶粉、硫酸镍胺、H2O2、DAB等；

电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、硝酸纤维素膜、移液枪、转膜用的夹子、海绵垫、滴管、滤纸、转膜槽、转移电泳仪、摇床、计时器、磁力搅拌器、转子、Western blot 盒等；

BCA kit、ECL kit等。

1. 转膜液的配制(1*)1L

试剂

剂量

Tris

3.028g

Glaline(甘氨酸)

14.4g

SDS

1g

先定容800ml，调制pH=8.3，然后+200ml甲醇，混匀。

2.蛋白电泳Buffer(5*)1L

试剂

剂量

Tris

15g

Glaline(甘氨酸)

72g

SDS

5g

直接定容至1L，无需灭菌和调pPH；使用前稀释至1*。

3.磷酸盐缓冲液(PBS，10*)500ml

试剂

剂量

NaCl

40g

KCl

1g

Na2HPO4·2H2O

7.2g

KH2PO4

1.2g

调制pH=7.4-7.5

5. PBST配制

1L PBS+5ml 20% Tween-20

6.封闭液(5%)

奶粉5g，溶于PBS，定容至1L。

7.按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶、上层胶)

成分

配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(mL)

5%胶

2

3

4

6

8

10

蒸馏水

1.4

2.1

2.7

4.1

5.5

6.8

30%Acr-Bis(29:1)

0.33

0.5

0.67

1.0

1.3

1.7

1M Tris-HCl, pH6.8

0.25

0.38

0.5

0.75

1.0

1.25

10%SDS

0.02

0.03

0.04

0.06

0.08

0.1

10%过硫酸铵

0.02

0.03

0.04

0.06

0.08

0.1

TEMED

0.002

0.003

0.004

0.006

0.008

0.01

8.根据目的蛋白的分子量大小选择合适的分离胶(下层胶)浓度

SDS-PAGE分离胶浓度

最佳分离范围

6%胶

50-150kD

8%胶

30-90kD

10%胶

20-80kD

12%胶

12-60kD

15%胶

10-40kD

成分

配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)

6%分离胶

5

10

15

20

30

50

蒸馏水

2.0

4.0

6.0

8.0

12.0

20.0

30%Acr-Bis(29:1)

1.0

2.0

3.0

4.0

6.0

10.0

1M Tris-HCl, pH8.8

1.9

3.8

5.7

7.6

11.4

19.0

10%SDS

0.05

0.1

0.15

0.2

0.3

0.5

10%过硫酸铵

0.05

0.1

0.15

0.2

0.3

0.5

TEMED

0.004

0.008

0.012

0.016

0.024

0.04

成分

配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)

8%分离胶

5

10

15

20

30

50

蒸馏水

1.7

3.3

5.0

6.7

10.0

16.7

30%Acr-Bis(29:1)

1.3

2.7

4.0

5.3

8.0

13.3

1M Tris-HCl, pH8.8

1.9

3.8

5.7

7.6

11.4

19.0

10%SDS

0.05

0.1

0.15

0.2

0.3

0.5

10%过硫酸铵

0.05

0.1

0.15

0.2

0.3

0.5

TEMED

0.003

0.006

0.009

0.012

0.018

0.03

成分

配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)

10%分离胶

5

10

15

20

30

50

蒸馏水

1.3

2.7

4.0

5.3

8.0

13.3

30%Acr-Bis(29:1)

1.7

3.3

5.0

6.7

10.0

16.7

1M Tris-HCl, pH8.8

1.9

3.8

5.7

7.6

11.4

19.0

10%SDS

0.05

0.1

0.15

0.2

0.3

0.5

10%过硫酸铵

0.05

0.1

0.15

0.2

0.3

0.5

TEMED

0.002

0.004

0.006

0.008

0.012

0.02

成分

配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)

12%分离胶

5

10

15

20

30

50

蒸馏水

1.0

2.0

3.0

4.0

6.0

10.0

30%Acr-Bis(29:1)

2.0

4.0

6.0

8.0

12.0

20.0

1M Tris-HCl, pH8.8

1.9

3.8

5.7

7.6

11.4

19.0

10%SDS

0.05

0.1

0.15

0.2

0.3

0.5

10%过硫酸铵

0.05

0.1

0.15

0.2

0.3

0.5

TEMED

0.002

0.004

0.006

0.008

0.012

0.02

成分

配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)

15%分离胶

5

10

15

20

30

50

蒸馏水

0.5

1.0

1.5

2.0

3.0

5.0

30%Acr-Bis(29:1)

2.5

5.0

7.5

10.0

15.0

25.0

1M Tris-HCl, pH8.8

1.9

3.8

5.7

7.6

11.4

19.0

10%SDS

0.05

0.1

0.15

0.2

0.3

0.5

10%过硫酸铵

0.05

0.1

0.15

0.2

0.3

0.5

TEMED

0.002

0.004

0.006

0.008

0.012

0.02

[实验步骤]

一、蛋白样本制备

1. 总蛋白提取

(1) 准备溶液

室温融解蛋白裂解液RIPA，加入蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物 (10X)，使最终浓度为 1X，混匀，立即放置在冰上。

(2) 不同样本

对于贴壁细胞：4℃ 预冷的 PBS 洗 2~3 遍，用细胞刮子刮下细胞，或用胰蛋白酶处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

对于悬浮细胞：用PBS 洗 2~3 遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

对于组织样品：剪取适量组织和适量混匀的蛋白裂解液于匀浆器中磨匀 (0.01 g 组织加上 50-100 μL 的蛋白裂解液)，直至看不见组织块；

(3) 裂解

细胞样品按 1×106细胞数加 100 μL 裂解液，冰上裂解 30 min (或冰上裂解 5 min，超声仪冰浴超声 20 s)。组织样品转移匀浆液于 1.5 mL EP 管中，置于冰上裂解 15 min；

(4) 抽提

12,000 rpm, 4℃离心 10 min，立即吸取上清至一预冷的 1.5 mL EP 管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。

2. BCA 蛋白浓度测定(具体请参详《实验技术(五)：蛋白浓度测定》)

(1)制备好 BSA 标准品，并将 BCA 试剂 A 液: B 液=50:1 配制适量 BCA 工作液，样品用预冷 PBS 进行稀释；

(2)将标准品和样品分别加到 96 孔板中；

(3)各孔加入 BCA 工作液，37 ℃ 孵育 30 min；

(4)酶标仪 562 nm 波长读取各孔 OD 值；

(5)根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

Tips:

1：合适的盐浓度下，保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。

3：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰(加入合适的蛋白酶抑制剂)。

4：样品建议分装成合适的量(比如分装出20ul检测蛋白质定量用)，然后保存与-20°或-80℃中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。

5：蛋白浓度低时，可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。

6：离心机提前预冷至4℃，防止蛋白变形降解。

7：蛋白原液浓度太高时进行稀释，用裂解液稀释。

二、SDS-PAGE电泳

1. 制胶(使用预制胶板请忽略此步骤)

(1) 准备玻璃板，确保两块玻璃板下缘水平且均无豁口，安装时内长外短，用手压实玻璃板及垂直槽制胶架。

(2) 倾斜垂直槽制胶架子装入垂直槽制胶固定架，注意为防止胶片变形漏液体，不要过分用力下压，并确保卡好。

(3) 按照每块 5 mL 配制分离胶 (1 mm 厚度)，轻轻混匀后立即铺板；

(4) 铺板后用异丙醇将分离胶液面压平(注：液封时要很慢，否则胶会被冲变型)；

(5) 凝固 40 min 后，吸干异丙醇，用ddH2O 轻轻冲洗并吸干；

(6) 按照每块 1.5 mL 配制浓缩胶，并插上合适大小的梳子，注意操作要迅速且水平，不能产生气泡；

(8) 40 min 浓缩胶凝固后从制胶架上拆下，用 ddH2O 将残留在胶板上的胶清洗干净，并用保鲜膜包裹住，立即使用或 4°C 储存。

2. 制样

加入 4×上样缓冲液混匀，100℃ 放置 10 min，迅速冰浴冷却。

3. 跑胶

(1)根据 BCA 测定结果，目的蛋白每孔上样量 20 μg-40 μg，内参蛋白每孔上样量 5 μg-10 μg；

(2)电泳时上层胶使用低电压恒压电泳，80 V，约 30 min；

(3)溴酚蓝进入下层胶时使用高压恒压电泳，120 V，至溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。

Tips:

1：上样时：根据蛋白表达丰度调整蛋白上样量，尽量保证每孔上样量保持一致。

2：胶最好现配现用，如果需要保存，最好用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。

3：为了检测整个实验系统或校准实验结果，需要设置内参(一般指由管家基因编码表达的蛋白)。

4：为了确保western blot结果的准确性和特异性，设置合适正确的对照是必不可少，一般需要设置的对照如下：

阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率；

阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性；

二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性；

内参对照：检测标本的质量和二抗系统；

空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果。

5：制胶关键是聚合时间，分离胶聚合控制在从加入10% APS和TEMED至开始凝胶，时间为10~20分钟(未完全凝聚)，浓缩胶最佳聚合时间为8~10 min，可通过控制APS和TEMED量来控制。

6：应待凝胶充分凝固后电泳，或者催化剂加入后充分混匀，否则条带容易中间凹陷两边翘起。

7：两板玻璃之间排除所有的气泡，防止条带中间鼓两边下陷。

8：加样前离心，选择适当的样本缓冲液，加适量的样品促溶剂，防止WB条带拖尾或蛋白出现纹理。

三、转膜(以湿转为例)

转膜步骤：

(1) 准备转膜缓冲液：

提前配制好转移缓冲液并预冷至 4 ℃；

(2) 准备PVDF 膜和滤纸：

将 PVDF 膜在甲醇中浸泡 30 s (从不透明变为半透明)，接着用 ddH2O冲洗膜表面，最后将膜和滤纸放入转膜缓冲液中；

(3) 处理凝胶：

轻轻撬开玻璃板，切掉浓缩胶和周围不需要的区域。将凝胶放入转膜缓冲液中，确保胶的完整性；

(4) 制备转膜“三明治”：

三明治夹套的黑色面向下，透明面 (或红色面) 朝上打开放置在干净的桌面上。从下依次往上放置海绵、滤纸、凝胶、PVDF 膜、滤纸、海绵。确保每一层之间都没有气泡，可以在放置最上层泡沫垫前使用滚轮轻轻滚动，以去除气泡；

(5) 转膜：

将夹套插入转移电泳芯中，确保黑色板朝向黑色板。然后将转移电泳芯放入转膜槽中，加入足够的转膜缓冲液，确保夹套完全浸没在缓冲液中。设置转膜电流为恒流，220 mA，根据蛋白大小不同设置转膜时间 (一般 30 kDa 以下转 30 min，30-70 kDa 转 60-90 min，70-150 kd 转 90-180 min)；

(6) 转膜后处理：

转膜完成后，取出PVDF 膜，用 TBST 冲洗膜表面，进行封闭等后续步骤。

Tips:

1：胶在负极，膜靠近正极；滤纸不要大过膜，防止短路；

2：夹好膜和凝胶后，确定在凝胶、膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。

3：注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜，避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率并产生背景污斑。

4：转膜过程中，尤其是高电流快速转膜时，通常 会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

5：对于湿转法：一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的>50KD的可以选用350mA，小片段的可以用250mA。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

6：转膜液可回收，重复使用2-3次。

7：PVDF膜具有疏水性，使用之前需用甲醇浸泡；NC膜则不需要甲醇激活，可以根据自己的实验需求来选择膜的种类。PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

8： 排列三明治时，尽量用干净的玻璃棒或试管赶走胶和膜之间的气泡，避免转膜不均匀。

9：确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否则会导致电流不能通过膜，从而转膜无效。

四、封闭

室温下，将转好的膜于摇床上用 5% 的脱脂牛奶 (TBST 配制)，磷酸化蛋白检测用 5% 的 BSA (TBST 配制) 缓冲液，室温封闭 1-2 h。

封闭液的主要作用是占据非目标结合位点，降低背景信号，从而提高检测的特异性和灵敏度。常用的封闭液：脱脂奶粉、牛血清白蛋白 (BSA)。

Tips：

1：封闭时间：室温1-2h、4度过夜或37度半小时。

2：封闭液pH：一般5%脱脂牛奶pH大约为6.0-6.5左右，而1%脱脂牛奶可能6.5-7。

3：5%脱脂牛奶封闭效果最佳，但有时也可能封闭过度，可以与BSA或无蛋白封闭液轮流更换。

五、抗体孵育

(1) 孵育一抗：稀释一抗 (TBST 溶解的 5 % 脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用 TBST 溶解的 5% BSA)，4℃ 过夜孵育。

(2) 洗膜：按照 3 次 TBST 进行洗膜，每次 5 min。

(3) 孵育二抗：一般使用 TBST 溶解的 5% 脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用 TBST 溶解的 5% BSA 室温孵育 1-2 h。

(4) 洗膜：按照 3 次 TBST，1 次 TBS 进行洗膜，每次 10 min。

Tips:

1：常见的封闭液有5%脱脂奶粉、BSA和Western Blot膜封闭液。但是封闭液的选取具体得看抗体说明书，有的抗体是明确要求只能用BSA，而封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求，但是一般情况5%BSA会比5%牛奶的效果好。

2：选择抗体时，一方面需要考虑所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一方面需要考虑所选抗体是否会引起交叉反应条带。

六、ECL显影

显影步骤：

(1) 在避光环境中，将 ECL 化学发光试剂 A 液、B 液 1:1 配置，充分混匀；

(2) 将 PVDF 膜置于化学发光成像仪载物台上；

(3) 用移液器吸取适量 ECL 混合液滴在 PVDF 膜上，确保工作液均匀覆盖在整张印迹膜上；

(4) 推入载物台，设置曝光时间进行图片采集 (可设置不同的曝光时间采集图像，从中选取曝光效果最佳的图像)。

Tips:

1：发光液建议现配现用，不同品牌的发光液稳定性不一样，最好的做法是现配现用；

2：条带需要稍微在吸水纸上沥干，再置于曝光黑板上，沿条带长轴均匀加入发光液，立刻置于暗室进行曝光操作；

3：当同时进行多个条带的曝光，不同条带之间加入发光液的间隔尽量缩短，尤其是高表达的蛋白条带，会由于局部底物被过渡消耗导致最终曝光时累积发光减少，从而显示蛋白表达呈现趋势或者内参不齐；

4：发光液与膜上二抗偶联的酶一旦接触，便开始进行催化反应消耗底物并产生化学发光反应，尽可能缩短发光液接触条带后与曝光开始的时间间隔，否则会导致曝光显出空白条带，并可能导致发光液先接触部位在开始曝光后的累积强度弱于发光液后接触的部位，从而形成肉眼可见的变化趋势，倘若不纠正错误的曝光操作，就会形成不真实的结果；

5：曝光时间是可以优化的，当自动曝光计算曝光时间过长时，可先进行短暂(如10s)曝光，视结果决定增减曝光的时间，低表达的蛋白可以延长曝光时间，通常5～10min，否则应该提高蛋白上样量。

6：过曝的问题：切忌不要过曝！

7：配制新鲜发光液，均匀快速添加并及时曝光，先接触底物部位与后接触底物部位的时间差异过大，在表达比较丰富的蛋白中由于底物的消耗过多，形成发光累积强度的差异，从而导致出现错误的差异。

[实验结果及数据处理]

将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值，比如bio-rad的Quantity One或Image J。具体请参详《Image J定量分析WB条带的灰度值》

Western blot结果的半定量分析可以利用灰度分析和光密度分析法。

目的蛋白灰度(或光密度)值=目的蛋白灰度(或光密度)/内参蛋白灰度(或光密度)

(注：灰度值或光密度值只是一个相对值，不同组间的灰度值对比，反映的是不同组间目的蛋白的变化趋势，并不是绝对定量值)

[注意事项]

1. 曝光过后，若是β-actin 这样的内参很明显的降解成了两条带，则说明5×loading buffer 中 DTT 或是β-巯基乙醇这类的还原剂失效。

2. GAPDH内参不齐，可能是一抗使用多次，更换新的一抗，或者是上样量的问题。

3. 对于特殊的分子量如小于10KD，大于300KD 的蛋白，久未做出，可选择更改膜的品种，如 PVDF膜，它亲和蛋白的能力大于NC膜，而且它根据膜的孔径半径分为几种型号(4.5um/0.22um)，可选择适合的型号来转特殊分子量的蛋白，一般蛋白分子大于20KD选择使用0.45um，小于20KD选择0.22um孔径的。

4. 配置30% SDS(聚丙烯酰胺)室温保存，也可直接用购买的SDS试剂。

5. APS(过硫酸铵)会失效，10% APS一般保质期才一个月左右，APS失效胶会不凝，要4℃避光保存。

6. 一般建议在预制Tris-Glycine小孔胶上样20-30μg总蛋白或100ng纯蛋白；对于组织，我们通常建议上样量最多100μg总蛋白，具体取决于靶标表达水平；但是，如果蛋白水平低于检测值，在电泳之前可能还需要进行免疫沉淀以富集待测蛋白。

7. 使用PVDF膜需要用甲醇激活，甲醇激活完成后充分清洗，去掉残留甲醇。

8. 显影液需要现用现配，避光，若过曝可尝试稀释显影液。

9. 漏胶：玻璃板没对齐，玻璃板底部缺损，密封条密闭不良。

10. 胶不凝：APS失效，也可能是TEMED失效或胶没凝好就被晃动。

11. 胶凝得不均匀：玻璃板没洗干净，表面有灰尘等杂质；试剂有沉淀、没混匀、APS变质。

12. 胶中有气泡：梳子下缘有气泡，梳子应先插一侧，再插另一侧。

13. 拔梳子后泳道有胶丝：TEMED的量太多导致胶凝得太快，插梳子之前胶已经部分凝固。

14. “微笑”条带：迁移过快；电泳温度过高。

15. 显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。

16. 一抗，二抗的孵育时间因抗体不同可做适当的调整。

17. 转膜时滤纸与胶，胶与膜，膜与滤纸之间不能有气泡，必须用玻棒擀走，有气泡会影响转膜效果。

18. 当跑大分子量蛋白，转膜遇到困难时，可以在转膜液里加入0.1%的SDS，甲醇浓度可以降低至10%甚至更低；SDS和甲醇在转膜中起相反的作用，SDS可以促进蛋白质从凝胶中洗脱，甲醇可以促进蛋白质与膜的结合，但会导致凝胶孔径减小，影响蛋白迁移；还会导致某些蛋白或碱性蛋白沉淀；此外，对于大分子量蛋白必要时可以采用湿转过夜，此外就是增加转膜时间、电流/电压；此外转膜不充分还可能是由于转膜时膜没有完全均匀润湿。

19. 当跑小分子量蛋白，转膜过度时，可以保持甲醇浓度在20%，降低转膜时间和电流/电压。

[常见问题及解答]

1. WB中目标蛋白的信息查询？

除了在以下数据库中内查询蛋白相关信息，也可以在参考文献中找到蛋白相关信息。

Uniprot：http://biogps.org/#goto=welcome 了解靶标蛋白基因信息、别称、功能、可变剪切、定位及可修饰类型等；

Proteinatlas：https://www.proteinatlas.org/ 通过IHC提供基因在正常组织和肿瘤组织中的表达变化和定位；

BioGPS：http://biogps.org/#goto=welcome 不同样本中基因的mRNA表达水平和靶标蛋白的表达水平；

PAXdb：http://pax-db.org/ 不同物种组织和细胞中蛋白丰度；

DepMap：https://depmap.org/portal/ 肿瘤细胞mRNA表达量。

2. 如何获得高质量的蛋白裂解物？

根据情况，结合超声、匀浆等物理方法，配合去垢剂裂解。

超声去除裂解样品中DNA干扰，经过超声处理过的样本得到的结果更清晰。

尽量使用新鲜的样品，新鲜的样品制备提取物背景较低。

3. 如何选择凝胶浓度？

凝胶的分辨能力由凝胶的孔径决定，孔径由浓度共同决定。原则有2点：

🚩高比例的凝胶具有较小的孔径，用于分离分子量较低的蛋白。

🚩低比例的凝胶具有较大的孔径，用于分离分子量较大的蛋白。

在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。

当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

4. 如何选择凝胶类型？

5. 膜的选择？

现阶段常用的转印膜主要是PVDF膜、NC膜这2种，PVDF膜可以提供更好的蛋白截留率、物理强度和广泛的化学兼容性。

①硝酸纤维素膜(NC)

a.NC膜对蛋白有很强的结合能力，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起。

b.NC膜的使用不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了。适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高。

c.NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间，不过注意纯的NC膜比较脆，容易卷，不适合用于需要多次重复清洗的用途。

d.要注意的是选择合适的孔径，因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的建议选择0.2um的，小于7KD的最好选择0.1um的膜。

e.一般而言，NC膜越纯，其蛋白结合能力就越高，混有含醋酸纤维素(CM)的NC膜结合力会有所降低。

f.由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween-20，而且浓度不要超过0.3%。

②聚偏二氟乙烯膜(PVDF)

a.与硝酸纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性能。硝酸纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm²，而PVDF膜结合量是100-200μg/cm²(而结合强度PVDF比NC膜强6倍！)。

b.PVDF膜更好的机械强度和化学耐受性使其在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；特别是需要做N端蛋白测序时，在相当“严酷”的清洗条件下，当尼龙或者NC膜已经降解的情况下PVDF膜依然保持完好。所以PVDF也是要做蛋白测序的唯一选择。但不适合荧光。

c.PVDF膜需要用100%甲醇浸泡(不超过15s)，再用缓冲液平衡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。PVDF膜非常适合于低分子量蛋白的检测。

6. 转膜的方法？

转膜的方法分为：湿转、半干转、干转，其中湿转是转膜最完全，应用最广的方法。

7. 转膜中的要点与建议

①大分子量蛋白：转膜缓冲液里加入0.1%的SDS；甲醇浓度降到10%甚至更少，用4℃湿转过夜代替半干法转膜；增加转膜时间、电流/电压；

②小分子量蛋白：去净缓冲液里的SDS；保持甲醇浓度在20%；用小孔径的膜；降低转膜时间、电流/电压；

③膜的方向确定: 转移后剪角做标记，分清正反面；用铅笔做记号或电泳时Marker上成非对称的；

④转膜后背景高: 选择NC膜；

⑤转膜时污染: 避免手指触碰膜，可以用镊子来取膜，油脂和蛋白质会弄脏膜；

⑥滤纸的大小：确保滤纸和膜的大小与胶一致，当使用半干法转膜时，过多的部分会阻碍电流穿过膜。

8. 如何封闭？

转膜完成后要用高蛋白的封闭剂对膜进行封闭，目的是防止抗体和膜发生非特异性结合。

🚩化学发光法：含5% 脱脂奶粉的TBST

🚩荧光法：含5% 脱脂奶粉的TBS

条件：室温封闭1小时

9. 一抗选择及孵育条件选择？

对于任何一种目的蛋白，都有不止一种有效抗体；为缩小选择范围，我们通常考虑以下几个方面：

①文献引用：根据官网了解该抗体发表文献的数量，如果发现该靶点的抗体有多个货号，那么尽可能选择发表文献较多的货号。

②反应性：根据自己实验动物的种属性选择合适的抗体，比如，实验动物是小鼠，那么一抗需要选择抗小鼠。

③实验应用：根据自己实验类型选择厂家验证过的抗体，尽可能选择的抗体能够满足多种类型实验，保证抗体的使用价值。

④抗体偶联物：标签结合在抗体上使抗体的结合可见，选择标签抗体以检测方法的为依据进行选择。一般推荐使用HRP标记二抗，不建议使用碱性磷酸酶(AP)标记二抗，因其不够灵敏。在二抗种类的选择上，二抗应来源于产生一抗的物种。

建议一抗4度孵育过夜，可以改善抗体结合。

10. 内参蛋白选择原则

内参在实验中扮演着至关重要的角色，想要挑选出靠谱的内参抗体？你需要遵循以下三个法则：

一、样本来源与特性

1. 样本种属来源：哺乳动物样本可选择 GAPDH、β-Actin 等；植物样本则选择Plant Actin、Rubisco 等；

对于研究较少的样本类型，可查阅相关文献以获取合适的内参蛋白推荐。例如：Shiyang Li 等人发现 gatB 基因是猪肺炎支原体最合适内参基因。

2. 样本组织特性：不同组织细胞的结构和功能有所差异，应选择在该组织中稳定表达的蛋白作为内参。

二、目的蛋白定位

三、目的蛋白分子量

为了确保目的蛋白与内参蛋白能够清晰区分，所选内参蛋白的分子量应与目的蛋白相差至少 5 kDa 以上。(方便在同一张膜上同时孵育内参抗体与目的蛋白抗体，更精确地反映样本间的表达差异)

举例来说，当目的蛋白的分子量为 45 kDa 时，可以优先选择GAPDH 或 β-Tubulin。GAPDH 的分子量约为 36 kDa，与 45 kDa 的目的蛋白相差足够大，可以清晰地区分开。

需要注意的是，没有一种内参适用于所有组织和细胞，以下是整理的一些特殊情况。

1. 组织特异性内参选择

(1)脂肪组织：β-Actin 的表达量非常低，不适合作为内参。

(2)多组织多细胞样本对比：GAPDH 作为代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定，因此多组织多细胞样本对比时，建议选用 GAPDH 作内参[6]。β-Actin 和 β-Tubulin 等结构蛋白在不同组织中会有表达差异。

2.修饰型蛋白检测时的内参选择

检测磷酸化、乙酰化等修饰型蛋白：β-actin 和 β-Tubulin 等结构蛋白表达相对稳定；

3.疾病或处理条件下的内参选择

(1) 缺氧、糖尿病模型、肿瘤组织：GAPDH 表达增高，不适合作为内参。(2) 抗癌和真菌药物处理：Tubulin 表达受影响，不适合作为内参。

4. 细胞功能或状态变化时的内参选择

(1)细胞增殖实验：c-Jun 自身表达会变化，不适合作为内参。

(2)凋亡实验：TBP、Lamin 在凋亡过程中表达或定位会变化，不适合作为核内参。

5. 特殊组织类型的内参选择

骨骼肌、心肌、平滑肌：Tubulin表达改变和特化，不适合作为内参。

6. 特殊样本类型的内参选择

血浆、乳汁、组织液等分泌样本：由于没有完整的细胞结构，可选择分泌型蛋白如 Transferrin 作内参。

11. 如何选择洗涤缓冲液？

建议使用TBST进行抗体稀释和洗涤。洗涤三次，每次5-10分钟。

对于图中所有抗体，TBST比PBST可以产生更强的信号。

12. 封闭液的选择

通常有两种常用的封闭剂，牛血清白蛋白(BSA)和脱脂奶粉。

一般来说，脱脂奶粉的封闭效果更强，但有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。

脱脂奶粉：性价比较高；通常使用浓度为2.5%~5%；不能用于磷酸化蛋白，因为脱脂奶粉中的酪蛋白本身是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。

牛血清蛋白(BSA)：通常使用浓度为2%~5%；某些抗体用BSA封闭会产生比脱脂牛奶更强的信号，确定抗体使用的特殊需求，选择适当的封闭剂。

较强的封闭剂稀释二抗可降低背景，建议用含5%脱脂奶粉的TBST稀释二抗。

如下图，用5%脱脂奶粉的TBST稀释二抗比BSA背景更低。

13. 无特异性条带

可能原因：如果 marker 正常，其他位置没有条带(1)抗体无特异性，即抗体不合适；(2)可能是一抗或二抗的种属弄错了，比如兔的加成鼠的。

解决办法：(1)靶蛋白完全无信号，但内参是正常的，大部分情况是一抗抗体失效或用错二抗种属；(2)靶蛋白和内参均无信号，则考虑是否发光液失效；(3)如果膜上没有 marker 则为转膜失败；(4)如果中间出现了细微条带，可能是蛋白上样量太少，或一抗浓度过低。出现这种情况的概率是非常小的，图3展示没有任何蛋白印迹信号，大概率是抗体加错了；如果中间出现微弱的条带，可能是蛋白上样量太少(因为有的蛋白表达本来就很少，对于这种情况可以增加蛋白上样量)，或一抗浓度过低，也有可能是ECL 发光液失效。

1)一抗二抗是否使用正确？

种属：一抗是否适用于样本种属；二抗是否匹配一抗？

孵育时间和用量不足；

如没问题，4度过夜，抗体浓度提高2-4倍。

2)蛋白上样量是否足够？

蛋白上样量过低，需要增加上样量

3)转膜是否充分、完全、过度？

充分：膜与转膜缓冲液浸润以及和胶的充分接触，可用丽春红S检测，避免甲醇浓度过高抑制蛋白转移

完全：分子量越大时间越长

过度：小分子量的降低转膜电压或时间

4)洗膜或封闭过度

降低洗膜次数

更换或降低封闭剂浓度，减少封闭时间

更换抗体稀释液，由脱脂奶粉换成BSA

14. 高背景(有条带但是背景不正常)

可能原因：(1)封闭物用量/成分/时间不恰当；(2)一抗浓度过高，导致抗体非特异性结合；(3)洗膜时间次数不够；(4)一抗孵育温度过高；(5)其它不恰当因素。

解决办法：(1)配制封闭液所用的脱脂奶粉应选用无防腐剂实验专用脱脂奶粉，检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭；(2)降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数；(3)室温37度封闭1小时以上(一般2小时)，4度封闭过夜，均在摇床上进行；(4)调整一抗的浓度(高背景很可能是抗体浓度过高)，可以进行梯度预实验。

1)一抗或二抗问题

降低抗体浓度和孵育温度

避免抗体和封闭剂的非特异性结合(磷酸化抗体和牛奶)

2)封闭不完全

BSA换成5%脱脂奶粉

提高牛奶浓度

延长封闭时间

3)洗涤不充分(非特异性结合没有被完全洗掉)

提高洗涤次数

提高吐温20浓度

4)曝光时间过长(条带过黑过粗)

减少曝光时间

延迟曝光时间

5)膜的选择(当背景还是很高)

NC膜>PVDF膜，相比之下NC膜背景更低

6)蛋白降解

加入蛋白酶抑制剂(可以翻倍加)

制样冰上操作

用新鲜样本

7)上样量过多(条带粗1秒曝出)

减少上样量

15. 条带大小不正确

1)多聚体或蛋白降解

增加还原剂(DTT)

充分变性

尽量使用新鲜样本

减少冻融次数(反复冻融会导致蛋白降解)

新鲜样本、冻融前加入蛋白酶抑制剂

2)多个亚型存在(Isoforms)

查阅文献或在线网站：Uniprot(https://www.uniprot.org/)

3)多个修饰位点

磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化、糖基化

4)Marker 条带有偏移

看内参的条带位置(根据内参的位置判断目的蛋白的位置是否争正确)

换marker

16. 显色不均匀，负片

1)蛋白量过多

降低蛋白上样量

2)一抗二抗浓度过高

加大抗体稀释度

17. 不均一污点或气泡

气泡可能原因：(1)在转膜的时候SDS-PAGE与PVDF膜之间存在气泡；(2)可能在转膜过程出现烧膜情况，尤其是半干转操作不当导致烧膜，因为半干转的时候不在有冰存在的情况下进行操作；(3)制作转膜的“三明治”时气泡没有赶完全；(4)PVDF印迹膜活化不佳。

解决办法：(1)在转膜的时候务必将SDS-PAGE与PVDF膜之间存在的气泡完全消除；(2)严格根据半干转的要求，进行适当的调整；(3)制作“三明治”时候，滤纸务必浸泡充分，在“三明治”制作时候，务必赶压气泡；(4)PVDF膜激活时间一定要足够，且全面激活。

1)膜上有气泡

轻柔去除膜上气泡，在转膜时尤其注意

2)设备污染

确保电泳仪清洗干净(遗留蛋白或胶碎片)

3)孵育或洗涤时溶液不足

确保在抗体孵育和洗涤时膜充分浸润

4)孵育时震荡不均匀

确保摇床或振荡器均匀摇晃

5)封闭液(牛奶)

牛奶要混匀，避免颗粒(建议转膜时就配好牛奶)

18. 条带弯曲，拖尾，形状怪异(如呈现哑铃状)

拖尾可能原因：(1)一抗浓度太高和孵育时间过长；(2)检测的靶蛋白浓度过高；

解决办法：(1)一般出现这种情况主要在大分子量蛋白检测实验过程中，因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的，因此可以调整一抗的浓度；(2)洗涤一抗和二抗的时候严格按照流程来做，建议 5min * 5次(当然也可以每次适当延长1-2分钟，或者加入足够的洗涤液体)，不用担心多次洗涤将抗体和蛋白洗掉，因为抗原和抗体的免疫结合是洗不掉的；(3)降低一抗孵育时间和蛋白的上样浓度/总量。

弯曲条带可能原因：(1)配制的SDS-PAGE胶体中存在气泡，或其它不溶性杂质，导致SDS-PAGE胶不均不平整。

解决办法：在配制SDS-PAGE时候，务必将配制试剂的容器洗涤干净；(2)如果多次出现这种情况，建议更换新的制胶试剂。

哑铃状可能原因：(1)哑铃状条带的出现大的可能性就是胶没有配置好，胶凝固后不均一；(2)蛋白样品中含有较多的杂质，离心收集蛋白时候未被离心到底部，和蛋白一起被收集，在电泳过程中杂质沉淀在蛋白印迹孔的中间，靶蛋白被挤到两边(可能较小)；(3)转膜“三明治”未紧贴在一起，转膜滤纸或海绵由于使用消耗，滤纸及海绵变薄，海绵弹性不足。

解决办法：(1)在配制SDS-PAGE时候，务必配置好，完好的SDS-PAGE在拔出梳子的时候，可见每个孔在一条线上，并无凹凸或此轮状；(2)提取蛋白的时候务必保证蛋白提取质量的纯度和完整性；(3)及时更换滤纸，或者在制作“三明治”的时候，保证“三明治”的是紧贴在一起的。

19.非特异条带

可能原因：(1)WB使用的一抗产生非特异性结合，此种情况大多数情况是因为一抗特异性不好；(2)提取的蛋白样品降解，蛋白酶将靶蛋白分解成若干个不同大小的蛋白，而这些不同大小的蛋白同样可被一抗识别。

解决办法：(1)建议更换一抗；(2)在蛋白提取的时候适当增加添加蛋白酶抑制剂，降低蛋白的降解。

20. 条带重影

1)荧光强度比较高

在压片时，放好之后不小心又轻微移动了一段距离

21. 非均一性背景(注意与高背景区分)

1)膜可能曾经干过

注意蛋白面不要风干

22. 只添加PMSF可以吗?

PMSF为苯甲基磺酰氟 (PMSF) ，是胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶和木瓜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶的抑制剂，而Protease Inhibitor Cocktail是多种蛋白酶的抑制剂，效果更全面。

23. 磷酸化蛋白和总蛋白在裂解时要注意什么？

磷酸化蛋白(如p-ERK)：蛋白酶抑制剂+磷酸酶抑制剂

总蛋白(如ERK):蛋白酶抑制剂

磷酸化蛋白+总蛋白：蛋白酶抑制剂+磷酸酶抑制剂

24. 蛋白定量方法选择

凝胶电泳时，要求蛋白的上样量尽量一致，后续的结果才更加可信。在电泳之前需要对样本中的蛋白浓度进行定量，常用的方法包括Bradford考马斯亮蓝法(染料结合)和BCA法(铜离子结合)。BCA法比Bradford法灵敏度更高，并且抗干扰能力更强。BCA兼容去垢剂，但是不兼容还原剂；Bradford法能够兼容还原剂，所以，可以根据裂解液的成分选择合适的定量试剂盒。

25. 蛋白变性的选择

许多蛋白质在天然条件下存在二硫键会形成多个分子的聚合体，另有少数蛋白质在制样的过程中也会自发形成二硫键，在裂解液中引入还原剂可以有效地还原二硫键，使得蛋白质都以单体形式存在。常见的还原剂有 DTT(二硫苏糖醇)和 BME( beta- 巯基乙醇)，在蛋白制备中这两种还原剂都具有较好的效果。

为了能使抗体接近抗原表位，必须将蛋白质的三维构型打开，因此需要将蛋白质变性。一般使用含阴离子变性去垢剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 的上样缓冲液， 95-100℃煮沸 5 min；

注意膜蛋白的变性：70℃加热10分钟，对于多重跨膜蛋白尤其建议,因为煮沸可能会使膜蛋白发生聚合。

26. 为什么细胞提取液中没有目标蛋白？

a) 细胞中并不表达这种蛋白质，换一种细胞或查文献弄清楚；

b) 细胞中的蛋白质被降解掉了，需要加入PMSF，抑制蛋白酶活性；

c) 抗体不能识别目的蛋白，检查抗体说明书，看是否有问题。

27. 细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？

a)有沉淀可能因为蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS的浓度，同时将样品煮沸时间延长，一般需96℃以上10-15min左右；

b) 也不排除抗原浓度过高，这时需再加入适量上样缓冲液。

28. 蛋白质分子量很小(10KD左右)，请问怎么做WB？

尽量选择0.2μm的膜，缩短转移时间；也可将两张膜叠在一起再电转。

29.显影液中显影1分钟和5分钟后，底片漆黑一片，是什么原因呢?

a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作，看是否有改善.；

b) 显影时间过长，一般3-5分钟就够了，特殊情况需摸索显色时间。

30. 细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？

有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长； 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

31. 最后显色时用DAB好还是ECM好？

DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级蛋白，具体可以根据你实验的情况。

32. 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？

①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western  blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定 量，但是不能定位。

②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

33. 细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？

一般5×106就足够了。

34. 同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？

能，没有问题。

35. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？

当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

36. 蛋白变性后可以存放多久？

-80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

37. 转膜时凝胶肿胀或卷曲？

可将凝胶在转膜前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min。

38. 检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？

可以。

39. 做组织样品的western的时候，怎样处理样品？

必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性。

40. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？

免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位)，有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

41. 二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？

不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用BSA代替应该好一点。

42. SDS-PAGE胶中蛋白的检测

电泳后常用的蛋白质染色方法主要有考马斯亮蓝染色法、银染法、负染法和荧光染色法。如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的锌染法，否则可以采用不可逆考马斯亮蓝法染色。

蛋白质负染法的原理是将金属离子有选择地沉淀在胶面上，而蛋白质条带不被染色。因此，蛋白质所处区域是透明的，从而达到检测目的。

②种类

该方法主要包括氯化钾负染法、氯化铜负染法、氯化锌负染法、氯化镍负染法、醋酸盐负染法和咪唑锌负染法等。

③缺点

该方法的对比度较差，且重现性受到诸多物理化学因素的影响(例如染色液的pH，胶中阴离子的浓度、温度等)，因此限制本方法的广泛使用。

④咪唑锌负染法

a.染色：电泳胶用蒸馏水洗30s，加入含0.1% SDS的0.2M 咪唑溶液摇动染色10-15min。

b.显色：用去离子水洗数秒，加入0.2M ZnSO₄溶液摇动直至在暗背景下蛋白出现透明条带，移去ZnSO₄溶液并加入去离子水中止显色。

c.脱色：胶置于0.1-0.25M Tris/0.25M EDTA，pH 8.0缓冲液中漂洗脱色两次，再置于电转缓冲液中开始转膜。

咪唑锌负染灵敏度高接近银染(1-10ng)，蛋白质与锌和咪唑的结合是可以逆转的，洗脱后的蛋白质化学性质没有改变，从而具有良好的质谱兼容性。

2)银染法

①原理

银染法的原理是在溶液条件下银离子能与蛋白质的天冬氨酸和谷氨酸上的羧基通过静电力相结合，同时银离子还可与组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和赖氨酸上的咪唑、巯基、甲硫基和氨基结合；接着，与蛋白质结合的银离子在甲醛等还原剂的还原作用下生成黑褐色的金属银使蛋白质显色。

②优点

灵敏度高，可以检测到0.25-1ng的蛋白质，非常适合低丰度蛋白质染色。

③缺点

甲醛的使用让凝胶中蛋白化学交联，导致质谱不兼容；线性范围窄，不太适合量化；核酸、脂类、糖脂类化合物常会对银染染色的结果进行干扰，导致实验重复率低。

3)考马斯亮蓝染色法

①原理

考马斯亮蓝是二磺酸化的三苯甲烷类染料，在酸性条件下，其可通过染料的磺酸基和蛋白质上质子化的碱性氨基酸间以静电力相结合。其次，还可通过染料的疏水性残基(苯环)和蛋白质的疏水性区域的作用产生疏水性力，同时也存在氢键和范德华力的作用。

②R250/G-250

R-250比G-250少2个甲基。其中考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用于蛋白质含量的测定，也可染胶，但脱色较慢较难。考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以常用来对电泳条带染色。

③方法

电泳胶用蒸馏水洗数30秒，用考马斯亮蓝G-250/R-250染液在室温摇床上摇动染色1h至过夜，回收染液，倒入数次去离子水摇动至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。

④缺点

染色灵敏度较低，约为几十纳克到几微克，对低丰度蛋白质的显现较差；染色时间较长，且凝胶有比较深的颜色背景，需要较长时间的脱色，影响实验效率。

4)荧光染色法

①原理

荧光染色法原理是荧光染料通过静电作用与SDS包裹的质子化蛋白质相结合，搭配荧光扫描仪成像来检测蛋白。

②缺点

a.荧光染料标记蛋白后会改变其在凝胶中的迁移性质，不同蛋白质样品含有与荧光染料反应的氨基残基不同，导致最终检测到的信号差别较大。

b.电泳前进行染料标记容易使蛋白质产生发夹结构，造成蛋白质在从凝胶向硝酸纤维素滤膜上转移时出现障碍；此外，荧光染料的化学稳定性差、光漂白和光降解现象比较严重。

43. 电泳上样样品的准备

1) 变性、还原蛋白样本

一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部分序列结构(表位)，因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构。蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如 SDS的上样buffer，并于95-100℃煮沸5min。

2) 天然和非还原样本

某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要进行非变性的WB，抗体的说明书一般会标注。这种非变性电泳不加 SDS，样本也不需煮沸。某些抗体仅识别蛋白的非还原态，loading buffer和电泳液中不加入β-巯基乙醇和或DTT。

44. 电转移缓冲液中SDS与甲醇的平衡、蛋白大小、胶的浓度对转膜效果影响。

①大蛋白(大于100KD)

a.对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶。

b.大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀，因此，转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为0.1%的SDS，以避免出现这种情况。

c.甲醇易使SDS从蛋白上脱失，因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。且降低电转移缓冲液中甲醇的比例可促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。

d.如果使用硝酸纤维素膜，甲醇是必需的，但如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入到电转移缓冲液中，但转膜前PVDF需用甲醇活化。

②小蛋白(小于20KD)

a.SDS妨碍蛋白与膜的结合，特别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加SDS。

b.保持20%的甲醇浓度。

45. 膜上蛋白的检测

为检测转膜是否成功，无预染蛋白Marker时可用丽春红染色。

1)染色方法

将膜放入TBST洗一次，再置于丽春红染色工作液中，在室温下摇动染色5min，大量的水洗膜直至水变清，无色蛋白条带清晰。(PVDF 膜需用甲醇再活化后用 TBST洗后进行封闭)

2)TBST

TBST是TBS+Tween的缩写，TBS是Tris-HCl缓冲盐溶液，为等渗盐溶液(0.9%NaCl溶液)加Tris-HCl缓冲液，用1N HCl调pH至7.4。Tween为一种非离子型去污剂，有复性抗原的作用，可提高其特异性的识别能力。

3)丽春红

丽春红溶液染色的原理是基于丽春红带负电荷的特性，它可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时也能与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色的条带。这种染色方法对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸馏水、PBS或其他适当溶液洗去。

参考文献

1. https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bmb.21516

2.https://histogene.co/western-3/

3. Pillai-Kastoori L, et al. Antibody validation for Western blot: By the user, for the user. J Biol Chem. 2020 Jan 24;295(4):926-939.

4. Selection of internal reference gene for normalization of reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction analysis in Mycoplasma hyopneumoniae. Front Vet Sci. 2022 Jul 22;9:934907.

5. Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies. Proteomics. 2005 Feb;5(2):566-71.

6. Selection and validation of reference genes for qPCR analysis of differentiation and maturation of THP-1 cells into M1 macrophage-like cells. Immunol Cell Biol. 2022 Nov;100(10):822-829.

7. Tissue-Specific Warburg Effect in Breast Cancer and Cancer-Associated Adipose Tissue-Relationship between AMPK and Glycolysis. Cancers (Basel). 2021 May 31;13(11):2731.

8. Overexpression of Krüppel-Like Factor 4 Suppresses Migration and Invasion of Non-Small Cell Lung Cancer Through c-Jun-NH2-Terminal Kinase/Epithelial-Mesenchymal Transition Signaling Pathway. Front Pharmacol. 2020 Jan 8;10:1512.

9. Applications of western blot technique: From bench to bedside. Biochem Mol Biol Educ. 2021; 49: 509– 517.

10. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Res Int. 2014:361590.

11. http://www.dxy.cn/bbs/thread/21360641#21360641

12. Western blot analysis. Methods Mol Biol. 2012;926:87-97