苍耳子中绿原酸含量的测定 高效液相色谱法 |
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一、摘要 本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定苍耳子中绿原酸的含量。色谱条件:C18色谱柱(4.6×250mm,5μm),流速为1.0mL/min,柱温为30℃,进样量为5μL,检测波长为327nm。实验结果:绿原酸峰的理论塔板数为9948;在连续进样7针的重复性测试中,绿原酸保留时间的RSD为0.162%,峰面积的RSD为0.391%;绿原酸的仪器检出限为0.104μg/mL,仪器定量限为0.345μg/mL;对苍耳子样品进行测定,苍耳子中绿原酸的含量为0.54%,加标回收率为87.9%。因此,Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《中国药典(2020年版)一部》中苍耳子中绿原酸含量测定的需求。 二、背景 苍耳子属菊科、苍耳属一年生草本菊科植物苍耳的带总苞的果实,属于常用中草药,具有散风、除湿、通窍等功效。 绿原酸是一种有机化合物,半水合物为针状结晶(水),110℃变为无水化合物,25℃水中溶解度为4%,热水中溶解度更大,易溶于乙醇及丙酮,极微溶于醋酸乙酯。绿原酸具有抗艾滋病毒、抗肿瘤细胞、抗菌、提高中枢兴奋、利胆、抗致畸、抗过敏及调节细胞色素P450连接酶的活性等功能。 三、实验过程 1范围 适用于苍耳子中绿原酸的含量测定。 2原理 苍耳子中的绿原酸经含5%甲酸的50%甲醇溶液超声提取,在327nm处有紫外吸收,使用高效液相色谱法测定,外标法定量。 3 试剂与材料 3.1水:符合GB/T 6682的一级水; 3.2甲醇:色谱纯; 3.3 甲酸:色谱纯; 3.4 5%甲酸的50%甲醇溶液:取500mL甲醇(3.2),加入50mL甲酸(3.3),用水定容至1L; 3.5 绿原酸对照品:CAS号:520-18-3,纯度:99.2%; 3.6 乙腈:色谱纯; 3.7 磷酸:色谱纯; 3.8 0.4%磷酸溶液:精密量取磷酸(3.7)4mL,用水定容至1L; 3.9 流动相:乙腈:0.4%磷酸溶液(3.8)=50:50; 3.10 市售苍耳子饮片样品。 4 仪器与设备 4.1高效液相色谱仪:K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站; 4.2分析天平:精确到0.0001g; 4.3 超声波清洗机; 4.4涡旋振荡器; 4.5容量瓶:10mL,棕色带刻度; 4.6具塞锥形瓶:100mL; 4.7 0.22μm微孔滤膜,有机相。 5 测定步骤 5.1 标准溶液的配制 5.1.1 绿原酸标准储备液:取绿原酸对照品(3.5)适量,用5%甲酸的50%甲醇溶液(3.4)溶解,配制成绿原酸浓度为1.0mg/mL的标准储备液。 5.1.2 绿原酸标准系列工作液:分别取绿原酸标准储备液(5.1.1)适量,用5%甲酸的50%甲醇溶液(3.4)配制成浓度分别为5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL、200.0μg/mL的标准系列工作液。 5.2 供试品溶液的制备 取经粉碎的苍耳子样品粉末约0. 5g,精密称定,置于具塞锥形瓶(4.6)中,精密加入5%甲酸的50%甲醇溶液(3.4)25mL,称定重量,超声处理40分钟,放冷,再称定重量,用5%甲酸的50%甲醇溶液(3.4)补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液(置棕色瓶中),即得。 5.3色谱条件 a)色谱柱:C18,4.6×250mm,5µm或者相当的色谱柱; b)流动相:详见3.9; c)流速:1.0mL/min; d)进样量:5μL; e)柱温:30℃; f)检测器及波长:紫外-可见光检测器,检测波长为327nm。 6实验结果 6.1 重复性测试 按照上述色谱条件(5.3)进行采集,绿原酸标准溶液(浓度为50μg/mL)的色谱图如图1所示,积分结果如表1所示。
图1 绿原酸标准溶液的色谱图
表1 绿原酸标准溶液色谱图积分结果 由表1中数据可知,绿原酸峰的理论塔板数为9948,满足《中国药典(2020年版)一部》中理论塔板数按绿原酸峰计算应不小于3000的要求。 将绿原酸标准溶液连续进样7针,叠加的色谱图如图2所示,结果见表2。
图2 绿原酸标准溶液叠加的色谱图 表2 绿原酸标准溶液连续进样7针重复性数据统计
将绿原酸标准溶液连续进样7针进行重复性测试,绿原酸保留时间的RSD为0.162%,峰面积的RSD为0.391%,具有良好的定性定量重复性。 6.2仪器灵敏度测试 灵敏度测试的色谱图如图3所示,计算结果见表3。
图3 仪器灵敏度的色谱图 表3 仪器灵敏度测试数据 通过计算,绿原酸的仪器检出限为0.104μg/mL,仪器定量限为0.345μg/mL。 6.3含量测定 6.3.1 校准曲线 按照上述色谱条件(5.3)进行采集,将绿原酸标准系列工作液(5.1.2)上机测定,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制校准曲线,线性方程和确定系数如图4所示。
图4绿原酸的校准曲线 由图4可知,绿原酸在测定浓度范围内呈现良好的线性关系,确定系数R2在0.999以上。绿原酸标准系列工作液叠加的色谱图如图5所示。
图5绿原酸标准工作液叠加色谱图 6.3.2含量测定 按照步骤5.2对市售苍耳子样品进行处理。依据公式(1)进行计算,苍耳子样品及苍耳子样品加标的色谱图如图6~图7所示。
式中:ω----为苍耳子试样中绿原酸的含量,单位为百分数(%); C----为通过校准曲线得到的试样中绿原酸的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); V----为试样的定容体积,单位为毫升(mL); m----为试样的质量,单位为克(g); 106和100----为换算系数。
图6 苍耳子样品的色谱图
图7 苍耳子样品加标的色谱图 由公式(1)计算苍耳子样品中绿原酸的含量,该样品中绿原酸的含量为0.54%,满足《中国药典(2020年版)一部》中绿原酸含量不得少于0.25%的要求,加标回收率为87.9%。 四、结论 通过对绿原酸的理论塔板数、重复性、灵敏度的测定以及对苍耳子中绿原酸含量进行测定,实验结果表明:绿原酸峰的理论塔板数为9948,满足《中国药典(2020年版)一部》中理论塔板数按绿原酸峰计算应不小于3000的要求;在重复性测试中,绿原酸保留时间的RSD为0.162%,峰面积的RSD为0.391%,具有良好的定性定量重复性;绿原酸的仪器检出限为0.104μg/mL,仪器定量限为0.345μg/mL;对苍耳子样品进行测定,该样品中绿原酸的含量为0.54%,满足《中国药典(2020年版)一部》中绿原酸含量不得少于0.25%的要求,加标回收率为87.9%。因此,Wooking K2025高效液相色谱仪可以满足《中国药典(2020年版)一部》中苍耳子中绿原酸含量测定的需求。 附1:仪器配置清单 附2:悟空Wooking K2025高效液相色谱仪(可靠、精准、友好、合规)
报告人:张帆 联系方式:15120069384 |
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