周 辰, 毕 群

(北京大学 生命科学学院 生物学国家级实验教学示范中心, 北京 100871)

对“胰岛素休克现象”实验的改进

周 辰, 毕 群

(北京大学 生命科学学院 生物学国家级实验教学示范中心, 北京 100871)

“胰岛素休克现象”是简单的观察实验,在2016年秋季学期中,北京大学生理学实验课程组通过增加动物数量,全班协作获得结果,得到可以进行统计分析的数据,学生不仅完成了传统的现象观察内容,也在实验设计、动物分组、统计计算等方面得到了训练。

胰岛素休克； 统计分析； 生理实验

作为大学基础实验课程的生理学实验,内容多为传统的经典验证性实验,越来越难以调动学生的学习热情。增加与实际生活相关的实验内容是提高学习积极性的手段之一。胰岛素是人体唯一的降血糖激素,由于血糖调节系统出现异常造成的糖尿病是当今的重要健康问题。我校生理学实验中曾经进行过注射胰岛素引起的低血糖效应以及休克等现象的观察实验[1-2],现在也有多种生理学实验教材收录了类似的内容[3-6]。这个实验操作容易,准备简单,实验材料可以使用小鼠[1-3,5-6],也可以使用兔[3-4]或者使用鱼类[3,7-8]等。虽然胰岛素休克实验可以很容易地在本科教学中开展,也能够在一定程度上引起学生的兴趣。但是目前的实验设计都过于简单,只能进行现象观察,内容不够充实,上课过程比较单调。为了更有效地利用教学时间,可以考虑增加实验内容,例如教材中常见的注射葡萄糖或者肾上腺素[9-10]治疗低血糖休克现象,或使用其他受体阻断剂等药物影响该现象的产生[11]。这些改进丰富了实验内容,但是实验结果仍然只是观察现象,而要得到有统计意义的结果,需要足够数量的实验动物。在科研工作中可以进行符合统计学要求的实验设计,但不具备在本科教学中开展的条件。鉴于实验分组和数据分析等训练也是本科教育的重要组成部分,可以考虑在以小组为单位分别观察胰岛素休克及挽救等现象的同时,以全班多个小组的数据总体进行统计。这样无需大量实验动物,并且胰岛素相关实验操作简单、结果明确,适合进行实验设计和统计分析的初步训练。

在2016年秋季学期,我校生理学实验课通过注射胰岛素引起低血糖休克现象,分析其出现时间与血糖浓度和胰岛素剂量的关系。对于此次实验的结果和经验进行了及时总结。

1.1 药品和仪器

实验使用的药品包括注射用人胰岛素(4 IU/mL),葡萄糖(50%),肾上腺素(0.1 mg/mL),生理盐水(0.9%),药品使用方式均为腹腔注射。使用家用血糖仪(欧姆龙HGM-114),通过剪断尾尖取血测定小鼠血糖浓度。

1.2 实验动物及分组

实验动物使用成年的白色昆明小鼠,均为雌性。2个教学班分别有18及20名学生,各分为5组,每组使用12只小鼠,其中4只小鼠正常喂食,到实验开始时空腹约6 h,8只小鼠空腹48 h。这些小鼠中,随机选择1只正常小鼠和2只空腹小鼠作为对照；3只空腹小鼠注射10 IU胰岛素,剩余3只空腹小鼠和3只正常小鼠注射40 IU胰岛素。

1.3 实验过程

学生随机取鼠,放入编号的透明塑料盒中。剪断尾尖取血,使用血糖仪读取其初始血糖浓度,随后按照分组计划注射相应剂量的胰岛素,对照组注射生理盐水。观察小鼠出现的现象,包括比较轻微的症状，如抖动和呼吸急促等,以及严重的症状及惊厥和休克,例如角弓反张、抽搐和翻滚等,分别记录发生时间。在出现严重反应后,再次测定血糖浓度,并随机选择惊厥小鼠注射1 mL葡萄糖或肾上腺素,观察是否有挽救现象以及没有采取挽救措施的小鼠的死亡情况。实验结束后断颈处死所有小鼠。

1.4 数据分析

各组实验结束后将发生反应的时间、血糖浓度等原始数据填入总表。数据表现方式为平均值±标准误,使用SPSS对数据结果进行统计分析,显著性标准为0.05,如无声明,统计方法均为studentt-test。

2.1 发生严重低血糖反应的比例

2个班的实验共使用120只小鼠,其中40只正常喂食,到实验开始时距离上次进食约6 h,另外80只空腹小鼠,距离上次进食超过48 h。空腹小鼠在行为上与正常喂养的小鼠没有明显差别,但血糖浓度有极显著差异(见图1),空腹小鼠为正常小鼠的63.2%。

图1 空腹小鼠(48 h)与正常小鼠血糖浓度

大多数注射胰岛素的小鼠,都很快出现发抖等轻微的低血糖现象,时间在5 min以内。继续观察，发现部分小鼠出现不同的症状,包括运动性下降、呼吸急促等。0.5 h后,开始出现惊厥、翻滚甚至休克等严重症状。对出现严重反应的小鼠数量进行了统计,结果令人意外,注射40 IU胰岛素的正常小鼠,比例为90%(27/30),远高于注射同样剂量胰岛素的空腹小鼠的50%(15/30),2组有极显著差异(百分比检验,P

2.2 发生严重低血糖反应的潜伏期

进一步总结了出现严重低血糖反应的时间,结果显示,在空腹小鼠中,高剂量组的惊厥时间显著短于低剂量组,而同样的高剂量注射后,空腹与否并不影响出现惊厥的时间(见图2)。在出现惊厥等现象后,再次测定了小鼠的血糖,成对比较，表明血糖浓度有了极显著的下降(见图3)。

图2 注射胰岛素后小鼠发生严重低血糖反应的潜伏期

图3 注射胰岛素前与发生严重低血糖反应后的血糖浓度

有趣的是,发生严重低血糖反应的时间与小鼠注射前血糖没有相关性。使用SPSS进行相关性分析显示,在正常注射40 IU、空腹注射10 IU组和40 IU组中,注射胰岛素前的血糖与惊厥潜伏期的相关系数分别为0.109(P= 0.612)、-0.3(P= 0.259)和0.056(P= 0.857),均无统计差异。此外,出现惊厥等严重症状的小鼠与没有惊厥的小鼠相比,注射前的血糖没有差异(见图4)。这说明严重低血糖反应出现与否以及潜伏期时长与注射前的血糖浓度无关。惊厥后测定的血糖浓度与发生潜伏期之间的相关性也进行了检测,注射40 IU胰岛素的正常小鼠和空腹小鼠中都有显著的负相关,相关系数分别为-0.495(P= 0.014)和-0.58(P= 0.038),注射10 IU胰岛素的小鼠组中也有接近显著差异的负相关现象,相关系数为-0.497(P= 0.05)。这些结果表明惊厥发生的越快,当时小鼠的血糖浓度越高。而2次测定的血糖浓度差值与发生惊厥的潜伏期之间也没有相关性,这提示血糖浓度过低并不是发生胰岛素休克现象的唯一原因,小鼠的个体差异也影响了发生惊厥的时间。

图4 发生惊厥和未发生惊厥的空腹小鼠在注射胰岛素前的血糖浓度比较

3.1 上课情况与结果分析

本实验操作比较简单,因此上课过程十分顺利,没有发生意外情况。学生在自己组内都观察到了应有的现象,除进行了统计分析的严重低血糖发生的比例和潜伏期以外,也观察到了注射葡萄糖的挽救效果。对于对照小鼠,在惊厥小鼠注射葡萄糖后也进行了同样剂量的葡萄糖注射,其中部分小鼠由于血糖浓度过高而死亡。注射肾上腺素的结果并不统一,有些产生挽救效果,有些造成死亡。对于这种小组合作和全班合作的实验形式,本学期是第一次开展,课后问卷显示,学生对此实验比较满意,在实验满意度排序中总分位于第2位。实验结果统计分析显示，空腹小鼠对胰岛素的反应显著小于正常小鼠,这是实验前没有想到的。这样不符合预期的现象对于学生的学习是有益的,可以培养他们认真对待实验结果、分析“异常”现象,得到更全面的训练。本次实验报告中,大多数学生都对此现象进行了讨论,很多学生查阅资料提出了自己的解释和假说,这对于分析结果和论文写作是一个很好的锻炼。

3.2 胰岛素使用中的问题

实验取得了比较好的效果,但是也有很多问题需要在今后的教学中逐渐解决。首先是药物的问题,在多种教材中均指出应使用pH2.5～3.5的酸性生理盐水配制胰岛素[3,5-6,12]，但在我们的预实验中,使用此类胰岛素注射后效果不如医院购置的人胰岛素注射液。也有文献指出使用酸性生理盐水并不能提高胰岛素的活性[13],因此在课程上使用了后者。药品说明中并没有给出溶剂的pH值,也没有除胰岛素外其他成分的浓度,造成无法设置标准的对照组。在实验中使用了正常的生理盐水作为对照,这并不符合实验设计的要求，因此课上会重点强调设置对照的规则,指出实验中的生理盐水只能作为部分对照。今后的实验中可以考虑将胰岛素溶液灭活后作为对照使用。

本次实验使用胰岛素的剂量与教材不符,教材中所用的剂量为每只小鼠2 IU,而我们通过预实验确定的剂量是10 IU和40 IU,远高于教材中的数值。从实验结果可以看出,出现惊厥等严重反应的时间,最快为32 min,记录的最晚出现时间是121 min，继续延长时间可能有更多的小鼠出现惊厥反应。预实验中注射各种剂量的胰岛素后，4 h内没有发生严重反应的小鼠,放置过夜后全部死亡,而未注射的小鼠全部存活。

大部分实验教材都要求将注射胰岛素的小鼠放于30～37 ℃下保温[3-6]。但由于本实验所用小鼠数量多,因此无法做到全部保温,只能在室温进行。这可能是所需胰岛素剂量过大的原因之一。由于要进行统计比较,因此不能只考虑最快出现惊厥的情况。超过2 h才会发生的现象,不适合在总学时为4学时的实验教学中进行观察和统计。由结果可知,剂量越小出现惊厥的时间越晚,因此我们认为此次实验的胰岛素剂量选择是比较合理的。

今后的改进方向可以包括进一步细化剂量分组,增加一个更低的剂量组。此外就是增加保温和加热,尽量提高小鼠所在位置的温度,得到更好的实验效果。

3.3 血糖测定的问题

本次实验使用家用血糖仪测定小鼠血糖浓度,这个方式比较简便,但准确性较差，并且其测定范围是1.1～33.0 mM,在惊厥后测定的血糖浓度接近测量下限,准确度会更低。而注射葡萄糖后部分小鼠血糖浓度超上限,无法测定。虽然有这样的问题,但这种方式还是值得采用。使用生化方法手动测定血糖浓度工作量过大,也不符合生理学实验的教学目的。需要在教学中让学生清楚测定准确度的情况,了解根据不同目的选择不同实验手段的理由。

3.4 对今后实验教学的启示

对于实验的后续开展,可以设置更多的测量条件。例如本次实验使用了空腹48 h的雌性小鼠,而教材中使用的都是空腹24 h的小鼠。也有研究显示空腹12～24 h之间不影响胰岛素的作用[13]，因此可以在实验中增加空腹24 h组。也可以通过实验证实其他条件的影响,例如比较雄性和雌性之间的区别,或者腹腔注射和皮下注射方式的不同。除了处理方式外,也可以研究药物对低血糖休克发生的影响。这些都是可以增加的实验条件。经过一段时间的积累,也可以在此基础上启发学生自行研究新的影响因素。这样能够培养学生设计实验的能力,并且通过没有明确结果的探索性研究,提高学生的学习兴趣。

全班整体协作进行实验以得到统计结果是本次实验的特点,但由于数据来自多组,也出现很多问题,例如由于判断标准不同,造成对时间的确定不一致，而学生注射操作的熟练度也有差别,有的组可能没有完全注射进腹腔,或者损伤了内脏等,这些因素造成结果的不统一。在很多学生的实验报告中也提出这一点,建议给出明确的可操作的标准,这也是今后实验的改进方向之一。

对胰岛素休克实验的改进可以使学生得到更全面的、贴近实际科研工作的训练,对于扩展实验课程功能、提高教学质量有重要意义,同时也能够提高学生的学习兴趣。这样的改革对于生理学实验这类传统课程是非常必要的。

References)

[1] 韦建恒.胰岛素低血糖休克[J].生物学通报,1992(3):51.

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[13] 谈永萍,魏智清,于洪川.胰岛素休克小鼠血糖变化的研究[J].宁夏师范学院学报(自然科学),2012(3):62-65.

Improvement on experiment of insulin shock phenomenon

Zhou Chen, Bi Qun

(National Demonstration Center for Experimental Biology Education, School of Life Sciences， Peking University, Beijing 100871, China)

The insulin shock phenomenon is a simple observation experiment. In the fall semester of 2016, the physiological experiment course group of Peking University worked together and achieved the results and data that could be statistically analyzed by increasing the number of animals. The students not only completed the traditional observation of the phenomenon, but also

the training in the experimental design, animal grouping, statistical calculation, etc.

insulin shock; statistical analysis; physiological experiment

10.16791/j.cnki.sjg.2017.08.042

2017-01-10

国家自然科学基金基础科学人才培养基金项目(J1310033)

周辰(1975—),男,江苏无锡,博士,工程师,研究方向为神经生物学和电生理学.E-mail：[email protected]

G642.423；Q455

A

1002-4956(2017)08-0168-04