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湖北医药学院基础医学院免疫教研室，湖北 十堰 442000, Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China

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湖北医药学院基础医学院免疫教研室，湖北 十堰 442000, Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China

探究结直肠癌（CRC）细胞（HCT116、Caco-2）条件培养基促进癌症相关成纤维细胞（CAFs）形成的机制，为CRC治疗提供新的思路。

将对数生长期的人正常结直肠成纤维细胞（CCD-18Co）分为对照组、HCT116细胞条件培养基处理组（HCT116-CM组）、Caco-2细胞条件培养基处理组（Caco-2-CM组）、300 nmol/L ERK抑制剂SCH772984组（iERK组）、HCT116-CM联合ERK抑制剂组（HCT116-CM+iERK组）、Caco-2-CM联合ERK抑制剂组（Caco-2-CM+iERK组）。采用RT-PCR和细胞免疫荧光检测CAFs相关分子标志物表达水平；利用RTCA、克隆形成和创伤愈合实验测定细胞增殖、克隆形成和迁移能力；Western blot检测HCT116-CM和Caco-2-CM激活的成纤维细胞信号通路，同时检测相应信号通路阻断后CAFs形成情况。

HCT116-CM和Caco-2-CM可上调CCD-18Co中CAFs标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、成纤维细胞活化蛋白（FAP）、纤连蛋白（FN）和转化生长因子-β（TGF-β）的mRNA表达水平并促进成纤维细胞向CAFs转化（P < 0.05）。HCT116-CM和Caco-2- CM促进CCD-18Co细胞的增殖、克隆形成和迁移（P < 0.05）。HCT116-CM和Caco-2-CM增强CCD-18Co细胞中α-SMA蛋白的表达和ERK磷酸化修饰水平（P < 0.05），ERK抑制剂SCH772984可抑制α-SMA的表达并抑制CRC细胞条件培养基的促CAFs形成作用（P < 0.05）。

CRC细胞可通过激活成纤维细胞的ERK通路诱导CRC相关CAFs的形成。

To investigate the mechanism by which conditioned medium of colorectal cancer cells promotes the formation of cancer-associated fibroblasts (CAFs).

Normal human colorectal fibroblasts (CCD-18Co cells) in logarithmic growth phase were treated with the conditioned media of colorectal cancer HCT116 cells (HCT116-CM) or Caco-2 cells (Caco-2-CM) alone or in combination with 300 nmol/L ERK inhibitor SCH772984. The expression levels of CAFs-related molecular markers were detected in the treated cells with real-time quantitative PCR (RT- qPCR) and immunofluorescence assay, and the changes in cell proliferation, colony formation and migration were assessed with RTCA, colony formation and wound healing assays; Western blotting was performed to detect the activated signaling pathways in the fibroblasts and the changes in CAFs formation after blocking of the signaling pathway.

HCT116-CM and Caco-2-CM significantly upregulated mRNA expression levels of CAFs markers (including α-SMA, FAP, FN and TGF-β) in CCD-18Co cells, and strongly promoted fibroblast transformation into CAFs (P < 0.05). The two conditioned media also promoted the proliferation, colony formation and migration of CCD-18Co cells (P < 0.05) and significantly increased the levels of α-SMA protein and ERK phosphorylation in the cells (P < 0.05). The ERK inhibitor SCH772984 obviously inhibited the expression of α-SMA and the transformation of CCD-18Co cells into CAFs induced by the conditioned medium of colorectal cancer cells (P < 0.05).

Colorectal cancer cells may induce the formation of colorectal CAFs by activating the ERK pathway in the fibroblasts.

结直肠癌（CRC）作为常见的消化道恶性肿瘤之一，多发生于直肠和结肠交界处。目前CRC的早期诊断仍然十分困难，多数患者确诊时已伴有肿瘤多处转移。肿瘤转移是肿瘤性疾病死亡的主要原因，且癌细胞转移过程中需要与宿主免疫系统相互作用，这个过程主要发生在肿瘤微环境（TME）中[1]。虽然目前许多研究集中于驱动CRC进展的遗传和表观遗传力量，但对复杂的TME了解仍较少。

TME由肿瘤细胞、成纤维细胞和免疫细胞等不同细胞类型组成，并存在与癌细胞转移、侵袭和耐药性形成有关的主要调节和驱动因子，与肿瘤发生和发展密切相关[2, 3]。在正常人结直肠基质细胞中，成纤维细胞遍布邻近结直肠粘膜上皮的固有层，其主要功能是对组织损伤做出反应并释放生长因子，以促进再生修复，同时维持各种组织结构和功能[4]。而癌症相关成纤维细胞（CAFs）因参与血管生成[5]、免疫抑制[6]和分泌促进癌细胞生长和迁移的因子[7]，长期以来被认为是CRC的致瘤成分。在肿瘤组织中，大多数CAFs是由固有成纤维细胞分化产生的[8]，并被定义为肿瘤组织中一组独特的活化成纤维细胞[9, 10]。研究发现肿瘤细胞和成纤维细胞之间可通过某些细胞因子介导的信号传导促进CAFs产生[11]，表现为成纤维细胞中CAFs相关分子标记物如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）高表达[12, 13]。其中，α-SMA在CAFs形成中起关键作用，高表达水平的α-SMA目前已被公认为基质成纤维细胞活化成CAFs的显著特征。且α-SMA+CAFs数量与肿瘤恶性程度增强和治疗耐药密切相关[14]。活化后的成纤维细胞获得了进一步的分泌表型、特殊的细胞外基质（ECM）重塑能力、强大的自分泌激活和动态免疫调节信号功能，进而促进癌细胞生长、侵袭与迁移[15-17]。鉴于CAFs在肿瘤发生发展中的重要作用，深入研究CAFs相关信息及活化机制将为肿瘤的致病因素及治疗干预策略提供新的思路。目前针对TME中CAFs形成及其功能的机制研究主要集中于胰腺癌、肺癌和乳腺癌等[18, 19]，提示在不同类型肿瘤中CAFs具有较大的异质性和动态变化，而在CRC相关的CAFs研究中报道较少。CAFs可促进肿瘤进展已被广泛认同，但是关于CRC细胞作用于成纤维细胞后其生长、活性变化及其是否向CAFs转化仍不清楚。目前被公认为可特异性调控细胞的多种生物化学过程的信号通路有JAK/STAT3、AKT/PI3K、mTOR和ERK1/2等，与各种肿瘤细胞、基质细胞和细胞因子相互作用有关。然而仍没有研究深入揭示CRC细胞刺激下正常结直肠成纤维细胞活化及其CAFs样表型改变的相关信号通路。因此本研究旨在探究CRC细胞（HCT116、Caco-2）的条件培养基促进人正常结直肠成纤维细胞（CCD-18Co）活化并诱导CAFs形成的具体机制，有助于了解肿瘤细胞除了调控自身代谢以外对微环境中成纤维细胞的调控作用。探究阻断成纤维细胞活化相关通路是否可直接减少CAFs的形成，可为新型靶向CAFs的药物研发提供新思路。

结直肠癌HCT116、Caco-2细胞和人正常结直肠成纤维CCD-18Co细胞（ATCC）；1640培养基、胎牛血清（Gibco）；Trizol、预染蛋白marker（Thermo Fisher）；反转录试剂、SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）；一抗稀释液、特超敏ECL化学发光底物（Biosharp）；青-链霉素、细胞裂解液、BCA试剂盒和抗α-Tubulin抗体（碧云天）；抗α-SMA、ERK、p-ERK、AKT、p-AKT、STAT3和p-STAT3抗体（CST）；ERK抑制剂SCH772984（MCE）。

取对数生长期的人CRC细胞HCT116、Caco-2，常规消化、重悬细胞并进行计数（1×106/mL），HCT116和Caco-2分别接种8 mL细胞悬液于10 mm皿中，待细胞生长至70%~80% 融合，吸弃旧培养基，以PBS润洗2次，更换无血清1640培养基，继续培养48 h后收集细胞上清液，3000 r/min离心10 min，留上清，0.22 μm孔径的滤器进行过滤，分装后即用或冻存于-80 ℃中备用。使用时与新鲜完全培养基以1 ∶ 1的比例混匀使用，保证细胞有足够的营养供应。

人正常成纤维细胞CCD-18Co分为对照组（完全培养基与无血清1640培养基1∶1混合后处理）、HCT116-CM组（完全培养基与HCT116细胞条件培养基1∶ 1混合后处理）、Caco-2-CM组（完全培养基与Caco-2细胞条件培养基1∶1混合后处理）、iERK组（对照组混合培养基+300 nmol/L的SCH772984处理）、HCT116-CM+iERK组（HCT116-CM组混合培养基+ 300 nmol/L的SCH772984处理）、Caco-2-CM+iERK组（Caco-2-CM组混合培养基+300 nmol/L的SCH772984处理）。ERK抑制剂SCH772984需提前加入CCD-18Co细胞中预处理2~4 h后再加入混合培养基，未添加SCH772984的其他处理组需补充相应剂量的DMSO，每组处理时间为72 h。

根据RNA提取试剂说明书提取细胞总RNA并保存于-80 ℃。用逆转录试剂盒取1 μg总RNA，加入5×qRT Super Mix 4 μL，Enzyme Mix 1 μL，补足ddH2O至20 μL，混匀离心后50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，将RNA逆转录为cDNA。PCR扩增cDNA 1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、SYBR qPCR Master Mix 10 μL、补足ddH2O至20 μL，混匀离心后上机。引物序列见表 1。以GAPDH为内参照。反应体系20 μL，PCR扩增条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，39个循环，分析熔解曲线。

RT-PCR的引物序列

Primer sequences for RT-PCR

PBS清洗细胞后，用4%多聚甲醛固定细胞15 min，清洗5次，5 min/次，加入血清封闭液（5%驴血清+0.5%Triton-100）室温封闭1 h，弃去封闭液。加入一抗（α-SMA1∶200）4 ℃孵育过夜。清洗5次，5 min/次，加入荧光二抗（1∶600）室温避光孵育2 h。清洗5次，5 min/次，加入细胞核染液（DAPI 1∶2000）室温避光孵育15 min，封片，荧光显微镜下观察并拍照。

PBS清洗细胞后，用细胞裂解液冰上裂解细胞30 min，4 ℃离心20 min，收取上清液，BCA法测定样品蛋白浓度。取10 μg样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离、电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗（α-Tubulin、α-SMA、STAT3、ERK、AKT 1∶1000，p-STAT3、p-ERK、p-AKT 1∶2000）4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次，10 min/次，IgG二抗（1∶5000）室温孵育1.5 h，TBST清洗5次，5 min/次，ECL法显色。以α-Tubulin作为内参照，电泳条带灰度值使用实验室仪器自带软件Image J进行分析，以目的条带灰度值与α-Tubulin条带灰度值之比表示目的蛋白的相对表达量。

将完全培养基与条件培养基1∶1混合制备成混合培养基，胰酶消化生长密度且状态良好的对数生长期的CCD-18Co细胞制成4×104/mL的细胞悬液，向E-plate中加入50 μL混合培养基，置于DP检测台上测量基线，再加入50 μL上述细胞悬液，并向各孔补充50 μL对应的条件培养基，对照孔补充无血清的1640培养基，每个处理接种4孔。放入37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，每隔15 min检测1次细胞指数，动态检测对照组和实验组的细胞增殖指数即可得到相应细胞增殖曲线。

取对数生长期的CCD-18Co细胞500个/孔，贴壁后加入相应的混合培养基，每组设3个复孔。每隔2 d换1次液，培养14 d后弃去培养基，用PBS清洗2次，再用4%多聚甲醛固定15 min，弃去固定液，加入结晶紫染色15 min后，回收结晶紫并清洗干净，常温晾干后拍照。

取对数生长期的CCD-18Co细胞，常规消化、重悬、计数。接种于6孔板中，1 mL/孔（约1×105/mL）。待细胞基本长满，用无菌200 μL移液枪的枪头进行垂直划痕，PBS漂洗2次以洗去划痕掉落的细胞，分别加结直肠癌HCT116、Caco-2细胞的条件培养基2 mL，对照孔加2 mL无血清1640培养基，每组设3个复孔。继续培养，每0、12、24、36、48和72 h时用倒置相差显微镜观察、拍照。利用Image J软件进行测量，计算面积、细胞的迁移率进行统计分析。

所有实验重复至少3次，数据经检验符合正态分布且具有方差齐性，以均数±标准差表示。用SPSS 23.0软件对所有实验数据进行统计学分析，均数比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

收集了单层生长48 h的HCT116和Caco-2细胞的无血清培养基上清即条件培养基（CM），加至成纤维CCD-18Co细胞后发现HCT116-CM和Caco-2-CM可刺激CCD-18Co细胞中CAFs相关分子标志物如α- SMA、FAP、FN和TGF-β的mRNA表达水平显著增加（P < 0.05，图 1A），同时细胞免疫荧光实验的结果也证明HCT116和Caco-2的CM可增强CCD-18Co细胞中α- SMA的表达（图 1B）。

HCT116-CM和Caco-2-CM可诱导CCD-18Co细胞向CAFs活化

Conditioned media of HCT116 and Caco-2 cells promote the activation of CAFs. A: Relative mRNA expression levels of α-SMA, FAP, FN and TGF-β detected by RT-PCR (Mean±SD, n=3; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group). B: Immunofluorescence assay for detecting the expression of α-SMA (green). Images of α-SMA staining (green) and DAPI staining (blue) are shown (Scale bar=50 μm).

分别检测HCT116-CM和Caco-2-CM培养后CCD-18Co细胞的增殖、克隆形成和迁移能力变化。结果RTCA、克隆形成及创伤愈合实验均显示HCT116-CM和Caco-2-CM可增强成纤维细胞的增殖、克隆形成及迁移能力（P < 0.05，图 2A~​~CC）。

HCT116-CM和Caco-2-CM可促进CCD-18Co细胞的增殖、克隆形成和迁移能力

HCT116-CM and Caco-2-CM promote the proliferation, migration and clone formation of CCD-18Co cells. The proliferation (A), clone formation (B) and migration (C) of CCD-18Co cells in each group were detected by RTCA, colony forming assay and scratch assay. Data are presented as Mean±SD (n=3). *P < 0.05, **P < 0. 01, ***P < 0.001 vs control group.

检测CRC-CM作用于CCD-18Co细胞后，CCD-18Co细胞中相关信号通路（JAK/STAT3、ERK1/2和PI3K/AKT）的激活情况，发现HCT116-CM和Caco-2-CM在促进CCD-18Co细胞中α-SMA表达的同时可激活ERK信号通路（P < 0.05，图 3）。尽管HCT116-CM可促进成纤维细胞中AKT信号通路的激活（P < 0.01），但Caco-2-CM则未发现可激活成纤维细胞中的AKT信号通路（图 3）。

HCT116-CM和Caco-2-CM均可激活CCD-18Co细胞ERK信号通路

HCT116-CM and Caco-2-CM activate ERK signaling pathway in CCD-18Co cells. The relative protein expression levels of α-SMA, STAT3, p-STAT3, AKT, p-AKT, ERK and p-ERK were detected by Western blotting. Data are presented as Mean±SD (n=3). *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group.

在筛选出iERK对CCD-18Co细胞的抑制浓度（图 4A）后，应用该浓度（300 nmol/L）的iERK预处理成纤维细胞2~4 h后再添加条件培养基或对照培养基，继续处理72 h后检测CCD-18Co细胞中α-SMA蛋白表达水平，结果发现iERK可显著抑制CRC-CM诱导的CCD-18Co细胞中α-SMA的表达（P < 0.05，图 4B）。同时RT-PCR检测后发现CCD-18Co细胞在iERK处理下CAFs相关标志物的mRNA水平也下降（P < 0.01，图 4C）。

iERK可抑制CRC-CM诱导的CCD-18Co细胞活化

ERK inhibitor inhibits HCT116-CM and Caco-2-CM induced activation of CCD-18-Co cells. A, B: Relative protein expression levels of α-SMA, ERK and p-ERK detected by Western blotting. C: Relative mRNA expression levels of α-SMA, FAP, FN and TGF-β detected by RT-PCR. Data are presented as Mean±SD (n=3). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group.

我们分别在处理CCD-18Co细胞的HCT116-CM和Caco-2-CM中加入iERK，并应用RTCA、克隆形成及创伤愈合实验进行检测，发现与未加iERK组相比，iERK可显著抑制HCT116-CM和Caco-2-CM诱导的CCD-18Co细胞增殖、克隆形成及迁移能力增强（P < 0.05，图 5A~​~CC）。

ERK抑制剂可抑制HCT116-CM和Caco-2-CM诱导的成纤维细胞的增殖、克隆形成和迁移能力

ERK inhibitor inhibits HCT116-CM- and Caco-2-CM-induced proliferation, migration and clone formation of CCD-18Co cells. The proliferation (A), clone formation (B) and migration (C) of CCD-18Co cells in each group were detected by RTCA, colony forming assay and scratch assay. Data are presented as Mean±SD (n=3). *P < 0.05, **P < 0. 01, ***P < 0.001 vs control group.

据2020年统计学显示，全球范围内CRC的发病率和死亡率均位居前三[20]。诊断效率低、易产生耐药性和远端转移是其不良结局的主要原因。CRC发生、生长及转移的内外环境称为TME，TME是由肿瘤、成纤维和免疫细胞等多种不同类型的细胞和多种调节并驱动癌症进展的细胞因子组成。其中成纤维细胞作为TME中比例最多且分布最广泛的细胞，本研究主要探究其在CRC细胞作用下的表型及信号通路变化，为靶向TME的CRC治疗提供新策略。

成纤维细胞是一类重要的间充质细胞，通过合成和分泌胶原蛋白等基质成分维持正常组织结构和多效性功能。在正常结直肠组织中，成纤维细胞均匀分布在邻近结直肠黏膜上皮的固有层，而在CRC组织中，这种统一结构丧失，具体表现为肿瘤细胞和基质细胞如CAFs等聚集，伴随大量血管生成。CAFs是TME中主要的细胞组分，在肿瘤进展中发挥广泛且重要的功能。近年来已有研究发现肿瘤细胞和成纤维细胞之间的相互作用可能是CAFs出现的原因之一。TME中固有成纤维细胞细胞是CAFs的前体，其中炎症环境下的炎性细胞因子如IL-1、IL-17和IL-11等均为成纤维细胞的强效刺激物并显著激活成纤维细胞[21-23]。当与成纤维细胞共培养时，肿瘤细胞可通过某些细胞因子介导的信号传导促进成纤维细胞活化并诱导CAFs形成[24]。活化后的成纤维细胞又可生成大量生长因子和ECM调节炎症和免疫，肿瘤细胞则从其释放的促生长因子中获得有利的生长、迁移和存活特性。因此肿瘤细胞是成纤维细胞活化的原因，活化的成纤维细胞则是肿瘤细胞促进自身进展的帮手。在本实验中，CRC分泌因子诱导活化的CCD-18Co细胞表达典型CAFs特征，其相关分子标志物如TGF-β、α-SMA、FAP和FN表达增加，增殖及运动能力增强，提示CRC-CM可诱导CCD-18Co细胞向CAFs活化并向典型CAFs表型特征转变。其中α-SMA在成纤维细胞转分化为CAFs中起关键作用，且在恶性程度更强、侵袭性更高的肿瘤中高表达[25, 26]。成纤维细胞中α-SMA的表达可一定程度上被TGF-β刺激，而CRC微环境富含TGF-β [27]。此外，FAP在正常组织中表达水平较肿瘤组织中低，α-SMA和FAP的表达量与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、病理晚期和不良预后显著相关[28]。且已有研究发现与正常成纤维细胞相比，活化后的成纤维细胞产生大量FN，并诱导癌细胞定向迁移[29]。鉴于CAFs在肿瘤中表现出多方面的作用，其有望成为有价值的肿瘤治疗的药物靶标。

促进肿瘤细胞存活的通路（例如JAK/STAT3、PI3K、mTOR/p70S6K1和ERK1/2）能特异性调节多个生物学过程，包括细胞增殖、存活和分化等。其中经典STAT通路介导大部分细胞因子应答活动，但也有一些以非STAT依赖性方式激活[30]。为探究CRC细胞对成纤维细胞作用的具体机制，我们检测其相关通路（JAK/STAT3、PI3K/AKT和ERK1/2）的激活情况，发现HCT116-CM和Caco-2-CM在促进CCD-18Co细胞中α-SMA表达的同时均促进了ERK蛋白磷酸化，尽管HCT116-CM也可促进成纤维细胞中AKT信号通路的激活，但Caco-2-CM则表现为相反的结果，提示HCT116-CM和Caco-2-CM虽均可诱导CCD-18Co细胞ERK信号通路激活，但不同CRC细胞或可通过多种信号通路调控节CCD-18Co细胞功能并导致其特性改变。HCT116-CM和Caco2-CM激活AKT信号通路的差异可能源自其培养上清中存在不同的效应成分。然而我们并未鉴定出CRC细胞影响成纤维细胞的具体细胞因子，根据文献报道，某些生长和趋化因子，如肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、TGF-β、IL-1、IL-6、IL-8和IL-11等，均可能在诱导成纤维细胞活化和促进肿瘤进展中发挥作用。近期有研究发现外泌体可快速激活成纤维细胞的ERK/MAPK通路，促进α-SMA高表达、胶原合成，并进一步激活TGF-β信号，最终诱导成纤维细胞分化。且TGF-β1可诱导活化肝星状细胞（HSC）产生大量IL-11，伴随ERK蛋白磷酸化和纤维化标志物表达[31-32]。同时ERK/Smad3信号通路参与了牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导的骨间充质干细胞（BMSC）转化为促进肿瘤进展的CAFs [33]。成纤维细胞中MEK/ERK信号可被FAP激活，下调FAP使ERK信号失活并抑制肿瘤细胞增殖和转移[34]。因此进一步探究具体的效应因子参与CRC细胞对CAFs的诱导作用，深入了解ERK信号通路与其外源性激活信号及下游底物之间的作用机制，将为CRC的诊断和治疗提供新的思路。

由于磷酸化ERK蛋白在肿瘤中经常异常表达，因此它的小分子抑制剂是潜在的肿瘤治疗靶点。近年来已发现一些主要作用于Ras/MEK/ERK通路的小分子抑制剂如曲美替尼和SCH772984等可通过多种途径抑制肿瘤进展中致癌信号的中心转导因子[35, 36]。有研究发现Ras和MEK相关抑制剂会使细胞产生耐药性，这种耐药性可导致ERK信号恢复，从而丧失抑制作用，但ERK抑制剂可以克服此类耐药性并更加有效和持久地抑制ERK信号通路[37]。且ERK1/2抑制剂可抑制活化的ERK通路参与的多种细胞及细胞因子诱导的成纤维细胞活化和肿瘤增殖、侵袭和转移[38, 39]。本实验的结果证明，SCH772984有效地降低了α-SMA、FAP、FN和TGF-β的表达水平，并拮抗CRC细胞诱导的成纤维细胞增殖和运动能力增强，提示SCH772984抑制了CRC细胞诱导的CAFs形成，CRC细胞可通过ERK信号通路促进成纤维细胞活化成CAFs。未来我们可应用ERK抑制剂于CRC动物模型中，为ERK抑制剂成为靶向CAFs治疗新方案奠定基础。

综上所述，本研究结果提示CRC细胞或可通过激活成纤维细胞的ERK通路诱导CRC相关成纤维细胞的形成，ERK信号的阻断可拮抗CRC细胞诱导的成纤维细胞活化和表型特征改变。本研究为CRC微环境中不同细胞间相互作用的分子机制研究奠定基础，同时提示ERK信号有望成为靶向CAFs治疗CRC的潜在靶点。

邓婷，硕士研究生，E-mail: moc.qq@439417244

国家自然科学基金（81772649）；十堰市科技局科研项目（2021K62）

Supported by National Natural Science Foundation of China (81772649)