细胞蛋白是指的不是在细胞膜上就是在细胞里面，包括细胞质蛋白和细胞核蛋白，还会涉及胞浆蛋白和胞核蛋白的提取，所以我们提取蛋白的第一步是瓦解细胞膜，让蛋白释放出来，第二步才是提取蛋白，提取蛋白就包括是总蛋白还是核蛋白，第三步就是蛋白定量。

第一步是裂解细胞，目前细胞裂解细胞有反复冻融法、超声波处理法、裂解液处理法等。由于反复冻融法、超声波处理法在一定程度上会影响到细胞蛋白的完整性，所以目前用的最多的是裂解液处理法。

细胞裂解液的主要目的：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性。

细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。

1、融解细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

2、对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。

对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。

3. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

裂解细胞之前先将细胞洗干净。因为在培养细胞的过程中，我们会用到血清，血清里面有各种各样的蛋白，而我们要测的就是蛋白质（但是是细胞里的，而不是血清里的），所以为了避免干扰，我们需要先用PBS将细胞洗两遍。洗细胞这一步操作对于贴壁细胞，可以选择在收集细胞之前做，也可以选择在收集了细胞以后再做，但是对于悬浮细胞来说就没得选了，只能先收集细胞再洗。如果是收集细胞之前洗的话，就先将原来的培养基弃去，接着加适量的PBS，摇动培养瓶/皿让PBS充分接触细胞将细胞洗干净，然后弃去PBS，换新的PBS再洗一次。洗完细胞以后再加1-2mlPBS，找个刮铲把细胞刮下来，然后把细胞收集到离心管里离心即可。如果是收集之后再洗的话，就先用刮铲把细胞刮下来收集到离心管里离心（悬浮细胞直接收集，不用刮），弃上清后加PBS重悬（洗细胞），再次离心，弃上清后用PBS再洗一遍就好了。

第二步就是蛋白提取。有总蛋白的提取和核蛋白的提取，

注意事项：

1. 尽可能提取完全或降低样本复杂度，只集中提取目的蛋白；

2. 保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH盐浓度，表面活性剂，还原剂等的选择）；

3. 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；

4：尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）；

5：样品分装，长期于-80℃保存，避免反复冻融。下面给大家简单介绍下提取步骤：

总蛋白的提取：

1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置 一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2、每瓶细胞加 3ml 4 度预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。

3、按 1ml 裂解液加10 ul PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无 结晶时才可与裂解液混合。）

4、每瓶细胞加400 ul 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂 解培养瓶要经常来回摇动。

5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪 将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）

6、于 4度下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷）

7、将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于－20 度保存。

核蛋白提取：

1. 向培养细胞的平皿中加入少量（保证在1.5ml TUBE内能放下）冷PBS(或 1*D-Hanks)

2.用细胞刮刀尽可能多的刮下细胞，收集到1.5ml的离心管中。  在预冷的离心机中，４℃，1000rcf，1－3分钟，沉降细胞。为尽可能多的获得细胞，可将一次离心后的上清再重复刮细胞一次；

2. 将细胞重悬于cell lysis buffer中（加入体积106细胞/200uL，体积估计方法还是没确定, 一般就是一个10cm平皿加1ml cell lysis buffer），添加蛋白酶抑制剂；先破细胞膜，得到细胞核；冰上放置（不震荡，可偶尔用枪轻吹）30分钟至1小时（此时核膜没有破，有核染色为证），充分裂解；（cell lysis buffer：5mM PIPES pH 8.0 ，85mM KCL, 0.5% NP40, 1% protein inhibitor;）

3. ４℃，1000rcf，20分钟，上清为胞质蛋白（蛋白浓度比较低，如需要检测，建议先浓缩一下），沉淀为细胞核；此时可以将沉淀冻存于－℃；

4. 将沉淀重悬于100-200ul nucleai lysis buffer（体积视目的蛋白表达丰度而定，一般50-100ul）中，添加蛋白酶抑制剂，冰上放置30分钟至1小时（每5分钟震荡一次），充分裂解；可以观察到沉淀慢慢消失，溶液变澄清（nucleai lysis buffer：成分同SDS lysis buffer； 50mM Tris-Cl pH 8.1, 10mM EDTA, 1% SDS, 1% protein inhibitor)

5. 4℃，最大转速离心，10分钟以上（尽可能沉淀完全），上清即为细胞核蛋白；

分离胞核和制备核蛋白抽提物的方法很多，但大多数制备核蛋白抽提物的制备方法都很耗时，并需要机械匀浆、冻融循环、反复离心或透析，而这些都可能影响核蛋白的完整性。所以很多客户提取细胞核蛋白的时候会选择自己购买试剂盒，例如Thermo ScientificTM NE-PER™ Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents使用了基于试剂的分离方案，能够分步裂解细胞并从胞浆中分离出完整的细胞核，然后再从基因组DNA与mRNA中抽提核蛋白。这一温和的过程可在两小时之内完成，且使用培养细胞时仅需标准的桌台式离心机即可。此外，用户还可以从细胞培养物或组织样本中分离得到具有活性的核蛋白与胞浆蛋白。所以小编更推荐各位购买商品化试剂盒。

第三步就是蛋白定量，蛋白定量最常用的两种方法BCA法、Bradford（考马斯亮蓝）法，BCA法比Bradford（考马斯亮蓝）法灵敏度高（BCA法灵敏度为0.5~20μg/ml，Bradford法灵敏度为1~20μg/ml），而且BCA法抗干扰能力强，线性条件好，所以更推荐大家选择用BCA法。

BCA法原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，吸光强度与蛋白浓度成正比。测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。