作为遗传物质的传递者，RNA复杂的生物学功能与生命健康息息相关，一旦其出现功能障碍，就会直接或间接导致许多疾病的发生。因此，为深入了解RNA的功能并阐明它们与疾病的关联，对其进行标记与成像已成为不可或缺的手段。在众多RNA标记与成像方法中，“荧光RNA技术”是近期发展的一种新技术：通过一段可基因编辑的RNA序列（RNA适配体）与目标RNA共表达，随后添加染料分子，使其与RNA适配体特异性结合并激活荧光，从而实现目标RNA的标记与成像。由于该方法具有操作简单、对靶标RNA干扰小以及信噪比高等优点，结合荧光染料种类多、光谱可调、光学性质优异等特点，因此在活细胞RNA成像与功能研究方面具有广阔的应用前景。尽管当前基于染料分子已经获得了系列多光谱的荧光RNA，但作为应用范围最广和仪器匹配度最高的绿色荧光RNA仍然存在细胞亮度低、光稳定性差的问题，限制了它们在活细胞中的应用。

针对以上问题，上海交通大学朱麟勇团队从荧光成像技术的核心——荧光染料设计——出发，基于染料结构设计解决RNA成像荧光亮度低和光稳定性差的问题，从而实现RNA的长时间动态追踪。该技术有望为活细胞层面RNA的长时间成像和动态追踪提供技术支撑，推动对RNA参与生理过程的认知。相关成果以“Imaging the dynamics of messenger RNA with a bright and stable green fluorescent RNA”发表于《Nature Chemical Biology》。论文第一作者为左方婷博士、蒋丽博士和苏倪博士。通讯作者为陈显军教授、朱麟勇教授和杨弋教授。这是该研究团队继去年九月份在《Nature Methods》期刊上报道荧光RNA成像技术以来的又一个突破性进展。

RNA拥有复杂的空间分布和动态轨迹，通常RNA从产生到降解需要经历一系列过程并在不同时期执行不同的功能，因此对RNA的长时间动态追踪对于深入了解RNA功能尤为重要。从探针设计角度看，RNA的长时间动态追踪要求探针一方面具有高的荧光亮度，便于在成像时采集更多的信号，避免伪影；另一方面要求探针具有优异的光稳定性，保证探针在长时间照射时不会发生光漂白而导致荧光强度下降。然而，当前绿色波段的荧光RNA，由于其所结合的荧光团在光照条件下会迅速发生光致异构并从荧光RNA复合物中解离下来，从而导致在RNA成像时存在荧光亮度低和光稳定性差的问题。这种低亮度和弱光稳定的问题往往导致在RNA成像时只能是以照片的方式记录RNA的定位和分布，而不能以视频的方式记录RNA执行功能的整个过程。

研究团队发现：当探针被RNA的三级结构完全包裹后，探针与RNA通过范德华力、π-π堆积、氢键等相互作用紧密结合。这种紧密结合一方面提高RNA与探针的亲和力，从而提高荧光RNA的荧光亮度；另一方面能抑制染料分子的光致异构，提高荧光RNA的光稳定性。因此，设计探针使其能被RNA适配体完全包裹并产生强相互作用，就有望提高荧光RNA的亮度和光稳定性。基于此，团队将探针的生色团部分设计成平面刚性结构，并在助色团的部分引入与RNA能形成强氢键相互作用的柔性链，获得了ACE分子（图1）。ACE “刚柔并济”的分子设计可以促使探针的生色团部分在与RNA结合时能很快被包住并产生强的π-π堆积作用；具有氢键供受体的柔性链能进一步通过氢键相互作用将生色团“锁”在RNA的结合口袋中并进一步增强RNA与探针的相互作用。团队验证了ACE与RNA适配体结合后产生强的绿色荧光，其在细胞中的荧光亮度与此前报道的其它绿色荧光RNA相比，高出一个数量级。在光稳定性方面，ACE与RNA结合后也展示出优异的光稳定性，其在长时间（120 s）连续光照的条件下，其荧光强度仍可保留初始荧光的90%以上，而当前报道的其它绿色荧光RNA在相同的条件下仅照射30 s则荧光迅速降低甚至消失（图1）。

图1 基于ACE开发的绿色荧光RNA在细胞中的荧光亮度和光稳定性质表征

基于该探针具备的高荧光亮度和强光稳定性，研究团队探究将其用于RNA超分辨荧光成像方面的研究。通过将该探针与团队之前报道的红色荧光RNA联合使用，成功实现了活细胞中两个mRNA的双色超分辨荧光成像。此外，为了进一步展示该类探针在长时间RNA动态追踪方面的优势，团队将其用于成像哺乳动物细胞内应激颗粒的形成及解聚过程，并成功观察到应激颗粒的产生以及由小到大的融合过程，成功揭示了ATP能量对应激颗粒的形成、运输和解聚过程的重要性（图2）。

图2 基于绿色荧光RNA的双色超分辨成像和对应激颗粒的长时间动态追踪

综上，此次该团队报道的绿色荧光RNA探针是目前最亮、最稳定的绿色荧光RNA探针，填补了活细胞单色或多色RNA成像中明亮稳定绿色荧光RNA探针的空缺，将为RNA复杂生物学功能与调控机制研究提供极具价值的实用工具，有望为活细胞生物传感、即时诊断甚至实时诊断技术的发展提供新的机遇。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-024-01629-x