无菌

•完整培养基，含有血清或任何其他必需的补充剂

•移液器

•15毫升螺旋盖的离心管

•不含钙和镁的PBS（CMF-PBS）

•胰酶

•2毫升螺旋盖细胞冻存管

•冻存培养基：含有5％（v / v）二甲基亚砜（DMSO）或10％（v / v）甘油的完全培养基

•台盼蓝染色液

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程序

冻存前检查

冻存前，细胞应处于指数生长期，确保细胞处于健康状态。理想情况下，应在收获细胞前24小时更换培养基。建议对培养物进行微生物污染物，特别是支原体的检测，并通过适当的方法，如STR分析确定其身份。

如果在培养过程中使用抗生素，那么建议在冷冻前1到2周不使用抗生素，这样如果出现污染，可以更容易地发现。

收集细胞

通常，您可以使用常规用于细胞传代的实验程序来收获细胞。细胞收获期间尽可能温和操作。本程序推荐的试剂量是针对为75平方厘米（T-75）培养瓶；若使用其他培养容器，请相应调整所用试剂量。

A 使用无菌吸管，取出并丢弃培养基。请妥善处置与细胞接触的任何材料和溶液。

B 用5到10ml CMF-PBS冲洗细胞，去除所有痕量的血清。

C 加入3到5ml的胰酶（在CMF-PBS中），37℃孵育。预热酶溶液通常会缩短处理时间。

D 在倒置相差显微镜上每隔几分钟检查酶处理的进展情况。一旦细胞变圆，轻轻敲击细胞瓶使其脱离塑料表面。加入5 mL含血清的生长培养基灭活胰酶。可能需要剧烈的移液操作来使培养容器底部的剩余细胞脱落，或将细胞团块分解成单细胞悬浮液。胰酶的去除或失活对于冷冻细胞至关重要。如果游离试剂不能直接灭活，可以通过下一步的离心去除。

E 用15ml离心管收集细胞。取出样本进行细胞计数，剩余的细胞悬液以约100×g离心5分钟以获得细胞沉淀。离心时，用细胞计数板对细胞进行计数。使用台盼蓝染液检查细胞的活性

冷冻保护剂

冷冻保护剂对于冷冻过程中细胞发生的损伤最小化是必要的。最常见的冷冻保护剂是二甲基亚砜（DMSO）和甘油。 DMSO（ATCC目录号4-X，5×5mL），常用浓度为5至10％（v / v）;最适浓度因细胞系而异。

注意： DMSO是一种非常强大的溶剂，能够迅速渗透完整的皮肤。因此避免直接接触DMSO，并妥善处理含有DMSO的废物。另外，选择DMSO时，确保使用无毒的产品。ATCC出售的DMSO，已经经过完全测试，以确保其无毒（ATCC目录号4-X，5×5mL）。

甘油常用终浓度为5％至15％。最佳浓度取决于细胞系。

通常，增加冻存培养基中的血清浓度来增加难以保存细胞的存活率。有时使用高达90％至95％的血清浓度（无培养基，仅血清加上低温保护剂）。

A 用冻存培养基重悬细胞，使最终细胞浓度达到每毫升2-5百万个活细胞。

B 在冻存管上标记好细胞名称，编号和冻存日期等信息。然后将1.0到1.8毫升的细胞悬液加入到细胞冻存管中并密封。

细胞冻存

对于大多数动物细胞，通常每分钟下降-1至-3℃。控制冷却过程的最好方法是使用程序降温系统。如果没有程序降温系统，可以使用程序降温盒，然后将其置于-70℃至-90℃冰箱中过夜。虽然这种方法适用于许多细胞系，但不能提供可控的，均匀的或可重复的冷却，不建议用于珍贵细胞。

无论使用哪种冷却方法，重要的是快速高效地将其传输到最终存储位置。如果转移不能立即完成，可以将小瓶置于干冰上一段时间。这样可以避免在转移过程中发生温度升高而损害细胞。在这个转移过程中温度升高是解冻后影响细胞活力的主要原因。

低温储存

始终保持储存温度低于-130°C。细胞可以在更高的温度下存活，但生存力通常会随着时间的推移而降低。理想的储存容器是液氮罐，其中细胞或者被浸没在液氮中，或者被悬浮在液氮上方的蒸汽相中。出于安全原因（以下＃6），优选气相储存。要维护液氮中储存的细胞需要记住以下几点：

A 确保标签系统适用于（永久）低温储存。

B 保持良好记录，包括细胞储存位置，生长特点和操作记录。

C 请频繁检查液氮罐的状态（最好每天或至少每周一次）。有多种商用警报系统可用于持续监控其状态。珍贵细胞应至少存放在两个不同的地点。

细胞复苏

细胞复苏：如果细胞保存在液氮中而不是液氮之上时，应特别注意。如果在储存期间冻存管发生泄漏，则会缓慢地充满液氮；在解冻时，液氮转换回气相可能会导致爆炸。

安全注意事项：将冻存管从液氮罐中取出并解冻时，请始终穿戴防护服，手套和面罩或护目镜。

A 通过在37℃的水浴中轻轻晃动解冻细胞。为了减少污染的可能性，O形圈和盖子应该保持在水面之上。解冻应该是快速的（大约2分钟）。一旦内容物解冻，将冻存管从水浴中取出，浸入或用70％乙醇喷洒。之后的操作都应该在严格的无菌条件下进行。

B 将内容物转移到25cm2的组织培养瓶或100mm组织培养皿中，并用完全培养基稀释。对于大多数细胞系来说，没有必要立即除去低温保护剂。正常情况下，解冻后8-24小时更换培养基以除去保护剂。然而，对于对冷冻保护剂敏感的那些细胞系，可以离心细胞悬液以去除冷冻保护剂。然后将细胞放置在细胞培养箱，37℃培养。在细胞恢复期间，避免培养基过碱。建议在添加细胞之前，将生长培养基置于培养箱中至少15分钟以使培养基达到正常pH。如果加入新鲜培养基太快，一些细胞系可能会发生渗透压休克。小体积的缓慢添加培养基可以提高它们的复苏率。

REFERENCES

Freshney RI. Culture of animal cells: A manual of basic technique, 4th ed. New York: Wiley-Liss; 2000.

Hay RJ. Preservation of cell culture stocks in liquid nitrogen. TCA Manual 4: 787-790, 1978.

Hay RJ, Caputo J, Macy ML , eds. Preservation of cell cultures in liquid nitrogen. In: ATCC Quality Control Methods for Cell Lines, 2nd edition. Rockville, MD: American Type Culture Collection; 1992返回搜狐，查看更多