二甲基亚砜（DMSO）是一种重要的渗透型细胞保护剂。在深低温（零下200度）保存细胞时冻存过程中，为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤，有必要使用含有DMSO冷冻保护剂。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。

一般使用时终浓度控制在5~10%，最佳浓度取决于细胞类型。

一般来说，存活率比较高的细胞系，培养基、血清、DMSO按照7：2：1的比例新鲜配制使用。

细胞计数后，用配制好的细胞冻存液重悬细胞，至5×10^6 ~ 1×10^7 cells/mL，然后1~1.5mL/管分装冻存。

对于存活率较低的细胞系，或者需要长时间保存的细胞系，可以增加冻存液中的血清浓度，血清和DMSO按9：1的比例配制。

另外，还有商品化的无血清冻存液可以选择，不需要预先配制。一般会含有多种保护剂成分，适用于特别珍贵的细胞的保存，例如干细胞、分离后的免疫细胞等等。

1.用移液器吸走原培养基，加入适量PBS洗1-2遍；

2.加入适量胰酶，置于培养箱中消化；

3.待消化到位后加入适量血清或完全培养基终止消化，800-1000rpm离心3-5min；

4.配制冻存液，待细胞离心后去上清，加入冻存液重悬，转移到冻存管中，注意冻存管做好标识；

5.将冻存管放入程序降温盒中，-80度过夜，然后转移到液氮中保存。

1.冻存步骤中包含了消化的大部分步骤。

2.冻存液常规配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1，如果细胞比较珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1；

3.如果没有程序降温盒，可以将冻存细胞依次放于4度1h，-20度2h，-80过夜，大部分细胞也可以适应，但原代细胞不建议这么处理；

4.冻存细胞储存在-80度中通常不建议超过半年，液氮中通常不建议超过2年；

5.细胞如果是第一次养，建议至少冻存两个批次以上，以尽量避免因为冻存问题导致细胞绝种；

另外，还有一些是无血清培养的细胞，也不能添加血清，这时就用无血清培养基（根据细胞特性定制的培养基）加入5-10%的DMSO来冻存。

细胞类型和细胞株个体特性。不同细胞有其冻存条件，不尽相同，需参考说明书和文献。如果发现细胞冻存后状态不佳，需要自己摸条件，或考虑污染和培养条件问题。

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