来源丨金斯瑞生物 

近年来，以嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）为代表的免疫疗法在癌症治疗方面取得了巨大的临床进步。然而， T细胞耗竭（T cell exhaustion）会严重影响癌症免疫疗法的治疗效果，这制约着新型细胞疗法的进一步发展。 T细胞耗竭是一种功能减退的状态，其特征在于T细胞效应功能和自我更新能力的逐渐丧失。 

近日，Nature 旗下综述期刊 Nature Reviews Clinical Oncology 发表了来自纪念斯隆凯特琳癌症中心的研究人员的 Jedd D. Wolchok 等人的题为： Clinical implications of T cell exhaustion for cancer immunotherapy 的综述论文。 该综述回顾了T细胞耗竭对肿瘤疗效的影响，并提出了在CAR-T疗法中克服T细胞耗竭的方法和途径。

CAR-T细胞耗竭的证据

CAR-T细胞治疗后的疾病复发仍然是现阶段CAR-T免疫疗法的一个主要挑战，这促使学者们去探索CAR-T细胞耗竭在肿瘤逃逸中的潜在作用。与内源性肿瘤反应性T细胞相比，CAR-T细胞以其基因修饰为标志，更有利于追踪和评估肿瘤靶向细胞。此外，下一代CAR-T细胞疗法可以进一步对CAR-T细胞进行基因编辑，以减轻或中断细胞耗竭。这些因素促使学者们去研究T细胞耗竭过程中的临床相关背景和重要模型。 

临床前体内模型对于理解CAR-T细胞耗竭程序至关重要。在黑色素瘤的小鼠模型中，肿瘤浸润性CAR-T细胞具有PD-1+TIM3high表型，与衰竭TOX和TOX2以及NR4A1、NR4A2和NR4A3的典型转录因子的表达增加相关。

同样，慢性抗原诱导的信号和组成性的、低水平的、基础的信号都会导致CAR-T细胞耗竭。这些临床前的发现表明CAR-T细胞具有耗竭特征的表型、转录和表观遗传特征。 

临床上，对治疗中或复发后活检样本的分析将有助于确定CAR-T细胞耗竭导致患者疾病控制丧失的程度。有学者向B-ALL病人体内输注 CD19靶向、基于4-1BB的CAR-T细胞，在4周后获取到了耗竭相关的DNA甲基化特征。另一项研究表明，输注后几个月，慢性淋巴细胞白血病患者的血液中持续存在TIM3+PD-1+ CAR-T细胞，这些细胞在临床结果较差的患者中富集。尽管在这两项研究中对循环耗竭的CAR-T细胞进行了全面的描述，但肿瘤微环境（TME）中 CAR-T细胞耗竭的数据相对缺乏，而TME通常是细胞耗竭最突出的地方。 

在接受抗CD19 CAR-T细胞注射的51例大B细胞淋巴瘤（LBCL）患者的肿瘤免疫环境研究中，研究者报告了循环CAR-T细胞峰值水平 (对应持久疗效) 与TME中耗竭的CD8+ T细胞的丰度之间存在负相关。然而，该评估没有区分耗尽的CD8+ T细胞是CAR-T细胞还是内源性未修饰的T细胞。注入的CAR-T细胞缺乏持久性可能会限制对其耗竭的评估。 虽然表征输注后CAR-T细胞的临床报告数量较少，但关于生产后和输注前体外CAR-T细胞表型的文献相对较多。低分化细胞比例较高的产品，如CD45RA+CCR7+ CAR-T细胞，与多种血液恶性肿瘤的预后改善相关。

此外，具有较高水平抑制性受体 (如PD-1和LAG3) 的CAR-T细胞产物在输注后扩增较少，并与慢性淋巴细胞白血病、儿童和年轻成人CD19+白血病或LBCL患者的较低应答率相关。虽然T细胞在刺激后5-8天表现出耗竭的表观遗传特征，但共抑制受体也在高功能、活化的T细胞上表达。因此，这些预输注数据强调了两个要点：(1) 除耗竭之外的其他细胞状态，包括效应子和记忆分化，可以解释T细胞的功能和持久性；(2) 仅基于共抑制受体的表达很难评估T细胞耗竭。

阻断CAR-T细胞耗竭

输注前和输注后的CAR-T细胞表型与来自临床前体内模型的数据表明了CAR-T细胞耗竭在临床结果上的限制作用。如果CAR-T细胞确实因耗竭而受损，那么中断这种功能低下的细胞状态就会提高疾病的治疗效果。CAR-T细胞耗竭程序的中断也许可以通过废除典型的TOX和NR4A转录因子或抗体介导的共抑制受体如PD-1的阻断来实现。 

不受控的NFAT信号导致耗竭相关T细胞转录因子NR4A和TOX的表达，从而加强了与耗竭相关的表观遗传和转录程序。删除Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3基因后则可以恢复功能和表观遗传程序，增强CAR-T细胞在实体瘤小鼠中的功效。类似地，具有短发夹RNA介导的Tox敲除的小鼠，其CAR-T细胞比Tox野生型细胞更持久且具有更强的治疗活性，特别是当Tox2基因缺陷时。有趣的是，其他研究表明，在患有肿瘤或慢性病毒感染小鼠中，Tox基因的缺失会导致凋亡增加和抗原特异性鼠T细胞的持久性受损。这种差异可以用Tox基因完全缺失的差异作用来解释，而shRNA介导的敲低则是使表达部分减少，而非完全缺失。

然而，综合这些结果，学者们担心T细胞内耗竭途径的分子中断可能会损害T细胞的适应性。 许多临床前研究和至少20个有效的临床试验都致力于通过阻断或消除PD-1信号传递以增强CAR-T细胞功能。他们通过多种方式实现CAR-T细胞中PD-1的功能性消除。其中最直接的方法就是用抗PD-L1抗体对患者进行联合治疗。在CD19靶向的CAR-T细胞治疗后疾病复发的患者中，用这种抗体治疗会导致病人外周血中CAR-T细胞的重新扩增；然而临床上的疗效反应则很少，在12名患者中仅有1例完全缓解和3例部分缓解。在28名患者参与的一项更大规模的临床研究中，抗CD19 CAR-T细胞和早期PD-L1阻断被联合使用，来治疗大B细胞淋巴瘤患者。

临床结果显示，持久的应答率与单独使用CAR-T细胞治疗的结果相似，这表明联合免疫检查点抑制剂治疗没有额外的益处。 一项来自一期试验的数据显示，在18例恶性胸膜间皮瘤患者中，靶向间皮素的CAR-T细胞产品和抗PD-1抗体的组合具有良好的疗效 (中位和1年总生存期分别为23.9个月和83个月)；然而，有一部分间皮瘤患者也会对单独的抗PD-1治疗产生反应。 

上述研究表明对PD-1信号的阻断不足以从表观遗传学上重新逆转T细胞耗竭程序，而只能部分逆转耗竭的转录表型。因此，在CAR-T细胞输注后，共抑制性受体阻断发生在早期 (当它能阻断低分化效应子中的抑制信号时) 还是晚期 (耗竭发作后) 更有效尚不清楚。CAR-T细胞是否会形成前体耗竭状态仍然有待研究。 在抑制PD-1或其他共抑制受体信号传导的其他方法中，有一种方法是改造CAR-T细胞本身以分泌拮抗抗体。此外，PD-1显性失活受体 (DNRs) 的过表达或者对CAR-T细胞中PDCD1基因座进行基因编辑可以从本质上消除PD-1信号传导。每种方法都有潜在的优点和缺点。

例如，CAR-T细胞原位分泌抗PD-1抗体可能会限制全身性抗体暴露，从而降低毒性。T细胞内的基因编辑方法则可以有效地消除编辑细胞中的信号传导，但不会增强内源性T细胞回应。缺乏细胞内信号结构域的PD-1 DNR的过表达可以通过与内源性PD-1竞争与微环境PD-L1的结合来减轻修饰T细胞中的抑制性信号传导。这些方法都被证明可以增强CAR-T细胞在各种血液和实体肿瘤中的临床前抗肿瘤功效。 

目前正在进行的，将PD-1阻断纳入CAR-T细胞治疗的大量临床试验将会产生更明确的结论。此外，在针对接受CRISPR-Cas9工程改造T细胞治疗的三名患者的早期研究中也产生了激动人心的结果。学者们发现，在这些患者中，带有PD-1缺失的T细胞的持久性低于PD-1未缺失的T细胞。这一发现可能有与PD-1生物学无关的其他解释，如多重编辑的遗传毒性应激；然而，它与在小鼠研究中的观察结果相一致，在小鼠研究中，PDCD 1缺乏和抑制性PD-1信号的丧失导致对慢性病毒感染有反应的抗原特异性CD8+ T细胞的过度刺激，最终引起细胞死亡。因此，效应期共抑制受体的表达可能有助于抑制T细胞过度刺激，未来学者们需要进一步通过研究来阐明能保留T细胞持久性和功能性，同时又能将PD-1 消除的最佳方法和时机。 

大量研究表明T细胞的最终耗竭是表观遗传固定的，并且普遍认为这些耗竭的后期阶段不太容易接受治疗干预，因此，针对T细胞分化途径的早期阶段的干预可能是提高抗肿瘤免疫的最有效方法。改善细胞培养条件和优化CAR设计及下游信号传导的策略，提供了缓解 （而非阻断） 诱导T细胞耗竭程序的可能性，从而增强CAR-T细胞功能。

提高CAR-T细胞与肿瘤细胞的比率

耗竭并不是纯粹的T细胞内在过程，还可能取决于肿瘤和患者的特征。肿瘤微环境 (TME) 中的代谢和基质因子可以调节T细胞耗竭。另外，癌细胞的特征可以决定CAR-T细胞疗法的疗效。例如，白血病细胞中的死亡受体信号传导受损可以诱导CAR-T细胞耗竭。此外，已经有学者注意到CAR-T细胞活性的疾病特异性差异。例如，与血液恶性肿瘤相比，CAR-T细胞对实体瘤的细胞毒性依赖于IFN受体信号传导。 除了癌细胞的定性特征外，其定量特征也可能决定CAR-T细胞疗法的疗效。

CAR-T细胞治疗的临床获益与多种疾病的肿瘤负荷呈负相关，包括急性淋巴性白血病 （ALL） 和大B细胞淋巴瘤 （LBCL） 。这一发现的一个潜在解释是较高的抗原负荷导致持续的CAR刺激，从而导致CAR-T细胞耗竭，这进一步论证了在CAR-T细胞治疗前减少癌细胞数量作为限制CAR-T细胞耗竭手段的可能性。这种策略可以以手术、放疗、靶向治疗或化疗的形式出现。 另一方面，可以考虑增加注入的CAR-T细胞的数量。

一项涉及LBCL患者的临床研究显示，输入病人体内的CD8+ CAR-T细胞数量与持久应答概率之间存在相关性。此外，输注的CD8+ CAR-T细胞数量与治疗前肿瘤负荷之比与持久应答具有统计学显著相关性。 一项针对输注CAR-T细胞的儿童患者的回顾性研究发现，随着组织细胞药物剂量的增加，患者的无事件生存率、无复发生存率和总生存率均有所增加。

然而，考虑到既往治疗史和疾病状态可能是CAR-T细胞产量的混杂因素，学者们需要在前瞻性临床试验中解决更高的CAR-T细胞剂量是否有益的问题。 此外，使用CAR靶向抗原进行疫苗接种是目前在研的另一种可能增加体内CAR-T细胞数量的方法。除CAR-T细胞外，内源性T细胞应答也可能有助于提高抗肿瘤活性。总之，多项研究发现表明，增加效应T细胞与肿瘤负荷之比的策略是减轻T细胞耗竭和改善临床结果的有希望的途径。

优化T细胞培养条件

临床级CAR-T细胞产品的制造需要有优化的收集步骤和标准化的操作程序。大量的临床前研究工作致力于改进CAR-T产品的制造过程，并减少CAR-T细胞耗竭。 在小鼠B-ALL异种移植模型中，仅培养3天而不是9天 （现行标准为7-14天） 的CAR-T细胞即使以低六倍的剂量进行输注，仍能在小鼠体内显示出更大的扩张性、作用持久性以及更强大的肿瘤控制能力。数据显示，9天的CAR-T细胞分化程度较高，反而限制了它们自身的增殖能力和效应功能。学者推测，培养9天的CAR-T细胞被更多地消耗，这表明较短的培养时间可能会缓解T细胞耗竭。 改变培养物中的细胞因子组成也可能会缓解T细胞耗竭。

与标准的IL-2补充相比，在IL-15存在的情况下培养的CAR-T细胞减少了细胞耗竭标志物的表达，增强了抗凋亡特性，并增加了增殖能力。此外，在CAR-T细胞制造过程中，PI3K-AKT信号通路的抑制与在小鼠模型中CAR-T细胞更大的扩张性、持久性和抗肿瘤活性有关。从机制上讲，使用双重PI3Kδ/γ抑制剂会导致CAR-T细胞耗竭标志物TIM3水平下降。因此，在CAR-T细胞制备过程中，改变细胞培养时间、补充相关细胞因子和抑制PI3K/AKT信号通路是一些有希望的临床试验途径，总的目的是减轻T细胞耗竭，从而提高CAR-T细胞治疗的疗效。

CAR工程优化信号传递

在内源性T细胞中，其耗竭是由重复刺激TCR时传递的信号驱动的。Shakiba等人进行了一项出色的临床前研究中，他们通过对目标肿瘤抗原的氨基酸修饰，在肿瘤特异性CD8+T细胞中获得了三种不同水平的TCR信号强度。值得注意的是，高信号强度与T细胞耗竭有关，但在小鼠模型中，低信号强度和高信号强度的TCR都不会产生最佳的肿瘤控制能力。相反，中等信号强度的TCR可以实现体内最佳的抗肿瘤活性。

在人体中，T细胞的持久性也与TCR亲和力相关，因此也与信号强度相关。

例如，在转移性结直肠癌患者中，四种不同克隆型过继转移的T细胞识别致癌基因KrasG12D的持久性与其TCR和同源新抗原-人类白细胞抗原-C复合体之间的3D结合亲和力呈负相关。以此类推，CAR组分的设计和选择会影响驱动CAR-T细胞功能、持久性和耗竭的信号。 有研究首次证明了CAR设计对共刺激区域T细胞耗竭的影响。与基于CD28的CAR相比，基于4-1BB的CAR设计的共刺激诱导的T细胞耗竭较少，相对应的代谢特征是呼吸能力增加、脂肪酸氧化和线粒体生物生成(与基于CD28的CARS增强T细胞糖酵解相反)。

磷酸化蛋白质组学分析表明，尽管基于CD28的CAR结构激活更快、效力更强，但这两个共刺激结构域诱导了相似的信号中间产物。进一步的研究发现了一个CD28信号基序 (YMNM) ，该基序负责VAV1和PLCγ1的激活和钙内流，从而驱动NFAT信号转导，进而导致经典转录因子的表达耗竭。将该基序中的天冬酰胺修饰为苯丙氨酸 (YMFM) 可减少CAR-T细胞的耗竭并增强其持久性。 与这些发现相一致，在一些实验模型中，基于4-1BB的CAR-T细胞比基于CD28的对应细胞表现出更强的持久性。然而，这种增强的持久性可能是有代价的，以CD19为靶标，具有CD28结构域的CAR-T细胞对低水平的抗原更敏感。抗原密度的降低已成为免疫逃逸多种工程化肿瘤靶向制剂的重要机制。尽管如此，在小鼠肿瘤模型中的研究已经证明了基于CD28和基于4-1BB的CAR-T细胞产品具有相似的总体疗效。此外，尽管没有直接比较研究，且基于4-1BB的CAR-T细胞检测到的持续时间更长，但这两个共刺激区域都在临床上使用且具有类似的疗效。 

 CAR信号的强度也可以通过编辑TCR派生的CD3ζ信号区域直接进行调控。

与内源性TCR的激活相比，CAR的激活可以诱导更强劲、更快速的CD3ζ磷酸化，从而产生更强的信号。在基于CD28的CAR结构中，通过消除该结构域中的两个基于免疫受体酪氨酸的激活序列来调节CD3ζ信号，可以减少T细胞耗竭，并在小鼠模型中更好地维持和控制肿瘤。 对CAR表达的调控可以进一步控制和优化信号传递。CRISPR-Cas9编辑TRAC可以使CAR基因结构能够将同源定向的位点，特异性插入到该基因座中，将CAR表达置于内源TRAC启动子及其相关调控元件的控制下。相比之下，标准的逆转录病毒转导的CAR整合在基因组内的半随机位置，导致表达水平不一致。

来自TRAC的CAR表达是一致的，并且与TCR具有类似的行为，例如由于CAR的内化、降解和重新表达导致的刺激后信号的瞬时抑制。在B-ALL小鼠模型中，TRAC驱动的CAR表达产生具有增强体内疗效和较少耗竭的表型的T细胞，它们与传统的CAR-T细胞相比，具有更高的疗效。将NY-ESO1特异性TCR可调控地、位点特异性地插入到T细胞中，同样会产生更好的肿瘤控制能力，并伴随着耗竭标志物的较低表达。 抗原非依赖性信号是慢性刺激的另一种来源，可导致过度的T细胞耗竭。某些CAR结构具有驱动结构性、低水平下游信号的内在倾向。这种信号的倾向是由CAR单链可变片段、铰链和跨膜结构域决定的，并被认为是由细胞膜上的CAR聚集所介导的。表现为CD3ζ的磷酸化和转录因子的过度表达的紧张性信号与T细胞耗竭有关，即使在没有靶抗原的情况下也是如此。

值得注意的是，CAR构建体可以在体外和体内筛选紧张性信号行为，从而学者们能够选择避免这种不希望行为的构造体。目前在临床中使用的高效CD19靶向的CAR构建体具有较低的紧张性信号传导倾向。因此，可以使用多种策略来设计CAR分子和其表达，以减轻过度信号传递，减少细胞耗竭，从而提高CAR-T细胞的效率。 鉴于过多的信号会导致CAR-T细胞耗竭，也有人提出了多种药物“关闭”信号的策略。

例如，酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼已被确认为CAR-T细胞的药理开关，因为它能够抑制CD3ζ的磷酸化。在不同的小鼠异种移植模型中，用达沙替尼短暂抑制CAR信号能够恢复耗竭的CAR-T细胞的抗肿瘤功能。研究人员得出结论，达沙替尼治疗通过减轻或逆转衰竭来提高CAR-T细胞的疗效。鉴于衰竭的表观遗传学参数是在达沙替尼治疗后不同时间评估的CAR-T细胞群体上进行的，因此，预防或真正逆转衰竭的表观遗传学特征是否是暂时性信号停止的主要机制目前尚不清楚。尽管如此，这项研究提出了一种潜在的缓解CAR-T细胞耗竭的药理学方法，并有望提高现有的广泛的CAR-T细胞疗法的疗效。

工程转录程序

T细胞功能和耗竭之间的平衡发生在TCR信号的下游，基于转录因子AP-1和其结合伴侣NFAT之间的平衡。上游TCR或CAR信号，包括紧张性CAR信号，驱动钙诱导的钙调神经磷酸酶激活，从而导致NFAT去磷酸化和核转位。经典AP-1是一个由Fos和Jun组成的异源二聚体复合体，由MAPK的初级TCR信号和CD28的共刺激信号诱导。AP-1和NFAT在T细胞中的协同作用导致IL-2的大量表达和效应器功能；然而，Fos和Jun的表达在持续的T细胞信号传递过程中丢失，会导致非对立的NFAT信号传递。因此，通过强制表达Jun可以克服由GD2特异性CARS强信号引起的T细胞耗竭，从而在小鼠模型中增强CAR-T细胞效率。转录因子ID3和Sox4也被证明是CAR-T细胞耗竭所必需的，CRISPR介导的ID3或Sox4的基因缺失导致在慢性肿瘤抗原暴露后可以增强对肿瘤细胞的体外杀伤作用。 

如上所述，耗竭部分是由转录因子通过经典的表观遗传程序强制执行的。事实上，这个转录程序的中断可能是导致CAR-T细胞功能行为发生戏剧性变化的第一个临床证据来自一个CAR-T细胞克隆的病例报告，该克隆带有表观遗传调节基因TET2的遗传缺失。TET2催化DNA中5-甲基胞嘧啶的氧化(从而促进去甲基化)，通过CAR载体在患者体内随机整合去破坏TET2，使得该患者具有先前存在的亚型TET2等位基因，导致CAR-T细胞克隆扩增，在高峰时的循环T细胞中占比达到94%。 TET2缺陷的CAR-T细胞克隆的这种优先扩增与细胞因子释放延迟综合征的发展和最初细胞输注数月后肿瘤的消退相吻合。被TET2破坏的CAR-T细胞被发现具有减少耗竭的表观遗传学特征，这表明消除表观遗传调节可以减轻T细胞的耗竭。

有趣的是，进一步的临床前工作表明，TET2干扰的效果取决于CAR信号特性(例如，发生在基于4-1BB的CARS中，而不是基于CD28的CARS)，这被归因于每个结构诱导的效应器分化水平的内在差异。此外，TET2的破坏最终使增殖能力和效应器功能分离，导致CAR-T细胞虽然过度增殖但功能低下，再次证明了中断广泛耗竭程序的复杂性。 2022年，CRISPR全基因组筛选结果显示，INO80和BAF染色质重塑复合体对于T细胞耗竭是必不可少的。重要的是，在过继转移的T细胞中，BAF复合体的一个组成部分ARID1A的功能失活导致表观遗传和转录变化，从而削弱了它们的耗竭，并在小鼠模型中改善了它们的持久性和抗肿瘤活性。来自第二项研究的初步数据强调了组蛋白甲基转移酶SUV39H1的类似作用，该酶先前被认为与T细胞干性的控制有关，SUV39H1的缺失导致B-ALL小鼠模型中抗CD19 CAR-T细胞具有增强的持久性和肿瘤控制能力。这一结果与减少共抑制受体表达的表观遗传变化有关。

缓解新陈代谢衰竭

持续的T细胞刺激与大量线粒体功能障碍有关。此外，代谢和肿瘤环境条件，如低氧，可以促进T细胞耗竭，并触发由转录抑制因子BLIMP1 （也称为PRDM1） 驱动的功能失调的代谢程序，导致转录辅助激活因子PGC1α沉默。事实上，在肿瘤特异性T细胞中过表达PGC1α可以增强小鼠模型中线粒体适合度和肿瘤控制能力。值得注意的是，线粒体生物发生受损与携带CD28共刺激结构域的CAR转导的T细胞体内持久性降低有关。这种线粒体功能障碍会增加活性氧的产生，从而限制了过继转移的CAR-T细胞的存活和自我更新；重要的是，用N-乙酰半胱氨酸或烟酰胺清除活性氧可以恢复抗肿瘤T细胞反应。有趣的是，与未接受CD19靶向CAR-T细胞治疗的患者相比，对自体CD19靶向CAR-T细胞治疗有完全反应的患者预先输注的线粒体质量更高。因此，耗竭程序可能已经演变为一种限制TCR过度刺激和相关代谢功能障碍的机制，如果不加以缓解，可能会导致T细胞死亡，从而失去持久性。 

综上所述，从信号传导，转录，表观遗传到代谢程序，对CAR-T细胞进行的多种修饰，已被证明可以潜在地减轻或者预防T细胞耗竭。更重要的是，许多有前途的工程策略正在向临床方向转化，这些即将进行的临床研究将会向我们提供更多关于如何最好地提高CAR-T细胞的治疗效果的信息。