摘　要：

1　氨基酰-tRNA合成酶及哺乳动物细胞中氨基酰tRNA合成酶的特点1.1　氨基酰-tRNA合成酶催化的反应氨基酰-tRNA合成酶家族( aaRS)参与生物体中的遗传解码过程。它们催化氨基酸与其对应的tRNA之间的酯化反应，生成氨基酰-tRNA参与蛋白质的生物合成，它反应的专一性确保了蛋白质生物合成的精确性。氨基酸与其对应的tRNA之间的反应发生在tRNA的3{$39}-末端腺苷酸核糖的2{$39}或3{$39}羟基上[1]。根据aaRS一级序列中的特征结构花式(motifs)以及催化功能域拓扑结构，aaRS被分为两类。每类有10种aaRS[2]。本文用氨基酸单字符或三字符后缀RS代表专一于某一氨基酸的氨基酰-tRNA合成酶。1.2　哺乳动物细胞中氨基酰-tRNA合成酶的特点1.2.1　两套蛋白质翻译系统　在哺乳动物细胞中，存在着两套蛋白质翻译系统：一套存在于细胞质中，负责细胞绝大多数蛋白质的翻译；另一套则位于线粒体中，负责一部分线粒体蛋白质的翻译。两套翻译系统均有自己独立的一套aaRS及tRNA。从进化的角度而言，线粒体aaRS与原核生物aaRS相似度较高，而相对细胞质aaRS不保守。这一现象与线粒体的内共生起源假说也是相符的。这种翻译系统的二重性使得很多以原核生物aaRS为靶点设计的药物具有线粒体毒性，从而给这类药物的设计与筛选增加了困难。1.2.2　末端延伸肽段　随着生物的进化，在高等真核生物中的细胞质aaRS的催化核心的N-端或者C-端多数存在着疏水的延伸结构域，这类结构域在原核生物当中往往是不存在的[3]。现在这些结构域被认为主要有以下三方面的功能: (1)某些这样的结构域是tRNA结合结构域，它们可以帮助aaRS在相对复杂的真核细胞环境内更好的识别相应的tRNA[4];  (2)这些结构域帮助aaRS构建一个大的复合物，这一点将在下一部分讨论；(3)这些附加的结构域还赋予了许多高等真核生物的aaRS除催化以外的新功能。现在已经发现，在哺乳动物当中许多aaRS都具有催化活性以外的新活性。哺乳动物的WRS和YRS可以通过蛋白酶水解激活或抑制血管生成因子[5~7]，人获得性免疫缺陷病毒(HIV)毒粒可以通过与KRS相互作用抑制tRNALys的氨基酰化，而tRNALys是HIV病毒RNA反转录的引物，因此，这一作用有可能影响HIV病毒基因组的复制[8~9]。人QRS能在谷氨酰胺存在的情况下与凋亡信号调控激酶1(ASK1)相互作用并抑制其导致的凋亡，这可能是早先发现的谷氨酰胺抗凋亡的分子机制[10]。人MRS可以在细胞受到某些细胞因子，如胰岛素、成纤维生长因子(FGF)、血小板源生长因子(PDGF)的刺激下，进入细胞核，并能促进rRNA的合成[11]。此外，人们还发现了一些aaRS可以和延伸因子的成员相互作用[12~13]，总而言之，高等真核生物的aaRS很多具有催化以外的一些新功能，而在这些新功能当中，最引人注目的是一个巨大的aaRS复合物(aaRS complex)的形成。1.2.3　细胞质中aaRS复合物　在高等真核生物中，九种aaRS和三种辅助因子共同构成了一个巨大的aaRS复合物，其中一种是具有双功能的单链酶。它们是：MRS、RRS、LRS、IRS、DRS、QRS、KRS以及双功能EPRS。三个辅助因子分别被命名为p18、p38、p43。虽然这个复合物在20世纪70年代后期就已经在许多哺乳动物的组织中被发现[3]，但直到近十年针对它的深入研究才出现较大进展。复合物中的9个酶相对于它们在原核生物中的形式均具有明显的N-端或C-端延伸，在这些疏水性的延伸中存在着几个多次重复出现的明显具有结构性的功能结构域，它们被认为可能参与了复合物的组装[14~16]。近期两项不同的研究分别用体内和体外实验证明了p38在这个复合物当中可能起着结构上的骨架作用[17~18]，在p38基因敲除的小鼠中检测不到复合物的存在，而且许多复合物成员酶的表达量以及氨基酰化水平均有明显的下降。这说明了这个复合物对于其成员酶的催化反应以及表达水平的稳定具有某种机制尚不明确的促进作用，也说明了这个复合物可能具有目前还未发现的有高度组织性的整体功能。最近发现的复合物成员与延伸因子的相互作用说明了这个复合物可能参与翻译延伸的整体调控，并有可能在先前发现的“通道”机制中发挥重要的作用[13,19]。此外，aaRS复合物中的三个辅助因子各自也具有非常重要的细胞功能，p43通过蛋白酶水解可以产生一种血管内皮单核细胞活化肽(EMAPII)，通过活化丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和核因子kB(NK-kB)，进而活化一系列下游效应分子，导致单核细胞的黏附和血管内皮细胞的凋亡[20~23]。p38可以通过泛素化的途径降解c-myc的转录活化因子远上游元件结合蛋白(FBP)，从而下调c-myc表达，对它的基因敲除导致小鼠的肺泡不发育[24]。p18最近被发现能通过与复制检查点激酶通路(ATM/ATR通路)的相互作用促进p53基因的表达，参与DNA修复损伤，从而可能具有较强的肿瘤抑制作用。对它的基因敲除显示，一个p18拷贝的失活都将导致小鼠的肿瘤发生频率大幅度的增加[25]。可见，这三个因子除了参与或组织整个复合物外，还具有重要的细胞功能，只是目前还不清楚这些细胞功能是否也和aaRS复合物具有一定的关系。1.2.4　线粒体中tRNA与某些疾病有关　与细胞质aaRS相比，线粒体aaRS及其相应的tRNA由于进化上比较保守，且形式上比较古老，因此到目前并没有发现它们有在催化功能之外的新功能。但是近年来的研究发现，在迄今为止发现的近200个致病性线粒体DNA突变中，接近一半都位于编码线粒体tRNA(hmtRNA)的基因上，而22种hmtRNA基因的总长度仅占线粒体基因组大小的10%。但很少有报道显示细胞质tRNA基因的突变与疾病相关。造成这种情况的原因主要是细胞质tRNA基因一般具有多个拷贝，而一个拷贝的突变一般不会对生命体的健康构成明显影响，但hmtRNA基因全部是单拷贝基因，任何一个tRNA基因上的突变都将直接影响到线粒体翻译系统的稳定性，而且编码tRNA的基因上的任何一个点突变对活力都可能有致命影响，不像蛋白质基因那样可以通过密码子的摇摆性和三级结构上的代偿可以在一定程度上抵消单点突变的影响。hmtRNA与人类疾病之间的高度相关性，吸引了众多科学家的研究兴趣。尽管hmtRNA基因突变导致疾病的分子机理还不清楚，但越来越多的证据显示，致病性突变会对hmtRNA的结构和功能造成严重的破坏。系统地研究hmtRNA的结构和功能特性，不但有助于我们了解线粒体中特殊的tRNA氨基酰化系统，还能帮助人们解释相关疾病发生的分子机理，甚至可能催生出新的诊断和治疗疾病的方法。2　哺乳动物细胞某些氨基酰-tRNA合成酶及其相关tRNA的研究2.1　人线粒体亮氨酰-tRNA合成酶(hmLeuRS)与致病tRNALeu的研究2.1.1　得到高活力的hmLeuRS　与hmtRNA不同的是，哺乳动物的线粒体aaRS均由核基因组编码，前体输入线粒体并切除前导肽后才能正常行使功能。尽管核基因组中编码线粒体aaRS的基因序列早已确定，但由于尚未确定它们进入线粒体后的成熟形式，因此对于线粒体中氨基酰化系统的研究一直难以开展。我们关于aaRS的研究便是从这个角度入手的。      早在1994年， hmLeuRS的cDNA就已经从人胎儿脑组织cDNA库中分离出来。为了研究hmLeuRS，本实验室将其cDNA进行克隆，并把一段带有6个组氨酸(6譎is)的标签融合到hmLeuRS的C-末端。利用昆虫病毒表达载体，我们在昆虫细胞内表达了hmLeuRS。在昆虫细胞中，hmLeuRS在胞质表达，并专一地定向进入昆虫线粒体。用Ni-NTA纯化的hmLeuRS的N-端序列为IYSATGKWTKEYTL，通过与已知的由cDNA推导出的hmLeuRS前体序列相比较，表明hmLeuRS前体输入到线粒体后，其N-端的Ser39和Ile40残基之间的肽键被蛋白水解酶切断，产生成熟状态的hmLeuRS。与先前其他实验室报道的hmLeuRS[26]相比，用这种方法得到的hmLeuRS氨基酰化大肠杆菌(Escherichia coli, E.  coli) tRNALeu的比活力提高8倍[27]。      在此基础上，我们将编码成熟形式的hmLeuRS的基因片段重组到E. coli的表达质粒中，通过转化E. coli受体菌，高表达并纯化了成熟形式的hmLeuRS。用此方法得到的hmLeuRS氨基酰化E. coli tRNALeu的比活力达到127.7单位/毫克，这是目前报道的具有最高比活力的hmLeuRS[28]。此高比活力的hmLeuRS为研究疾病相关线粒体tRNALeu突变体的致病机理带来方便。2.1.2　人线粒体tRNALeu(UUR)致病点突变体的氨基酰化活力降低　线粒体性脑肌病、乳酸中毒和中风样发作综合征(MELAS症)是线粒体遗传病的常见类型，有报道指出，位于编码人线粒体tRNALeu(UUR)基因中的五种点突变与MELAS症相关，它们分别是A3243G、A3252G、C3256T、T3271C和T3291C。我们构建并转录获得了这些tRNA突变体，通过体外的氨基酰化实验，测定了这些点突变对tRNA接受茎活力的影响。结果显示，和野生型tRNA相比，带有这五种点突变的tRNALeu(UUR)转录子的氨基酰化水平都有不同程度的降低，暗示MELAS症的发生与线粒体tRNALeu(UUR)氨基酰化能力受损有关。进一步的热稳定性实验显示，氨基酰化水平最低的A3243G 突变体和 T3291C突变体的结构不稳定。我们还发现，T3291C突变体能够竞争性地抑制野生型tRNA的氨基酰化，推测携带该突变的tRNA可能作为一种抑制剂存在于线粒体内[29]。2.1.3　发现人线粒体亮氨酸tRNA的CUN等受体(hmtRNALeu(CUN))T-茎上的碱基滑动现象　人线粒体亮氨酸tRNA的CUN等受体(hmtRNALeu(CUN))负责解码线粒体蛋白质编码系统中使用频率最高的密码子，目前有六个致病性点突变被定位于它的基因内部。体外实验显示，和野生型的hmtRNALeu(CUN) 转录子相比，疾病相关的T12311C(U48C)突变体的氨基酰化水平明显升高，动力学实验也证实U48C突变使tRNA更容易被氨基酰化。二级结构分析和结构探测实验均显示，野生型hmtRNALeu(CUN)具有比U48C突变体更为灵活的结构，这种结构柔性使野生型tRNA的T-茎能够在两种潜在的配对方式之间发生滑动。人为构建了一系列具有特定T-茎环结构的hmtRNALeu(CUN)突变体，用来模拟T-茎滑动到不同阶段时tRNA的分子构象。通过研究这些突变tRNA的结构和功能，我们发现这种特殊的T-茎滑动现象不但能够改变tRNA的分子构象，还可以调节hmtRNALeu (CUN)的接收茎活力，推测这可能是一种tRNA分子调节其自身结构和功能的新方式。分别将不同的tRNA分子固定在微球表面，以此筛选人线粒体中能够和特定构象的tRNA相结合的蛋白质， SDS-PAGE电泳图谱上蛋白质的差异条带提示我们，T-茎滑动受阻影响了tRNA与某些配体分子的结合，这些发现为我们探索相关疾病的分子机理提供了新研究角度[30]。2.2　人胞质氨基酰-tRNA合成酶的研究      在对几种人胞质aaRS的研究中，我们也取得了一些有意义的结果。2.2.1　人细胞质内两种精氨酰tRNA合成酶(hcArgRS)由同一条mRNA翻译产生　哺乳动物细胞内存在两种形式的hcArgRS，一种参与aaRS复合物的形成，另外一种以游离形式存在。相比游离形式的ArgRS(DNhcArgRS)，参与复合物形成的ArgRS(hcArgRS)在其N-末端多出了72个氨基酸的延伸肽段。这两种ArgRS是如何产生的？有人提出是由翻译后蛋白水解酶转移酶切得到，但是证据不足。我们在E. coli 中表达了编码hcArgRS 和 DNhcArgRS的基因，它们在E. coli中以可溶状态存在，而且DNhcArgRS的表达量和氨基酰化活力都比hcArgRS要高。利用DNhcArgRS的抗体进行Western印迹分析，在三种人体细胞中都发现了两种形式的ArgRS。对hcArgRS的cDNA进行分析，发现在其编码的开放阅读框内存在三个起始密码子，其中两个对应编码全长和去掉N-端72个氨基酸残基的ArgRS，另一个位于编码hcArgRS的mRNA的5{$39}非翻译区，并且与hcArgRS基因翻译具有不同的阅读框。分别突变三个起始密码子，并将相应的克隆转染293 T细胞，根据两种形式的ArgRS表达量的改变，证实两种ArgRS由同一条mRNA经过不同的翻译起始产生，并且由于上游起始密码子的存在，促进了编码 DNhcArgRS基因的表达[31]。2.2.2　人胞质亮氨酰-tRNA合成酶(hcLeuRS)延伸肽段的功能　我们将编码hcLeuRS的基因(hcleus)和缺失C-末端89个氨基酸残基的hcLeuRS的序列(DChcleus)，连接入经过改造的含有编码6譎is标签序列的昆虫病毒载体，然后感染Trichoplusia ni BTI-Tn-5B1-4(Tn5)昆虫细胞以表达hcleus和DChcleus，产生带有His6标签的hcLeuRS和DChcLeuRS，并利用Ni-NTA亲和层析纯化了这两种酶。测定了hcLeuRS和DChcLeuRS的动力学性质、热稳定性及细胞定位，发现C-末端结构域的缺失对酶的性质几乎没有影响。进一步研究了这两种酶与人胞质精氨酰tRNA合成酶(hcArgRS)和缺失N-末端的hcArgRS(DNhcArgRS)的相互作用，证明了hcLeuRS 的C-末端结构域与hcArgRS相互作用，这种作用通过hcArgRS的N-末端结构域进行。讨论了这种相互作用在aaRS复合物组装中的功能[32]。2.2.3　人胞质甲硫氨酰-tRNA合成酶(mcMetRS)N-端延伸肽段的功能研究　我们对真核生物胞质MetRS 的N-末端延伸的进化的研究结果表明，一个保守的、真核生物特有的九肽对于hcMetRS的活性中心的构成至关重要，缺失这个九肽的hcMetRS完全失去了氨基酰化活力，证明了在进化中出现的末端延伸可能参与酶的活性中心的构建，为更明确地阐释真核生物aaRS的进化提供了新的证据。2.2.4　哺乳动物细胞aaRS复合物中非aaRS蛋白质组分的功能研究　p43、p38和p18是aaRS复合物中重要的结构蛋白质，我们克隆了这三种蛋白质的基因，并对它们进行了表达和纯化，研究了它们对hcLeuRS和DChcLeuRS，hcArgRS和DNhcArgRS，N-末端缺失的人胞质甲硫氨酰-tRNA合成酶(DNhcMetRS)以及不同种属来源的LeuRS的活力影响，第一次用体外实验证明了这三种辅助因子对aaRSs的活力具有促进作用，这种促进作用和延伸的末端结构域并无必然关系，并且三种因子对LeuRS的促进作用还具有种属专一性。这些结果对我们进一步了解复合物的功能具有重要意义。

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