转基因Khao Dawk Mali 105(盐敏感)水稻三系过表达OsCam1-1［18]在吉田溶液中水培生长[40]，为期3周，采用完全随机设计。然后用150mm NaCl处理4h。采集幼苗，液氮速冻。种子的Aticl拟南芥突变体(GK-008E03)产自英国诺丁汉拟南芥储备中心。种子用75%乙醇快速冲洗去污染，用2% NaOCl浸泡10分钟，然后用含吐温80的消毒水冲洗5-8次，然后转移到Murashige & Skoog (MS)培养基(PhytoTechnology Laboratories®，USA)， 1% w/v蔗糖板。将种子播种在平板上，在4°C保存2天。然后将平板移入25°C的生长室或生长室，在16小时/8小时的明暗周期下进行1周。将植物转移到一个花盆中，花盆中含有种植材料，泥炭苔藓:珍珠岩:蛭石，比例为3:1:1，在相同的条件下生长，每2-3天浇水，直到植物成熟。种子在4℃下采收并储存。

用冷冻的研钵和研杵，用液氮研磨植物叶片样本，直到它们变成细粉。按照制造商的规程，使用TRI-Reagent®(分子研究中心，美国)提取总RNA，然后将RNA溶解在二乙基焦碳酸酯处理的水中。用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测提取RNA的数量和质量。用无rnase - DNase I (Thermo Fisher, USA)处理RNA，使用iScript™cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, USA)转化为cDNA。qrt - pcr使用SsoFast™EvaGreen®Supermixes (Bio-Rad，美国)进行。本研究所用引物的序列和PCR条件见附加文件3.．利用2——(ΔΔCT)和2——(ΔCT)方法EF1 -α作为内部控制。水稻基因表达分析采用4个生物重复，拟南芥基因表达分析采用5个生物重复。

构建了两个重组质粒进行表达OsICL拟南芥中的pAtICL-OsICL-pK2GW7，设计用于驱动OsICL表达式，使用本机AtICL子,p35SCaMV -OsICL-pK2GW7，设计用于驱动OsICL利用35花菜花叶病毒(35SCaMV)启动子过表达。利用拟南芥异柠檬酸裂解酶基因上游2138 bp的pCAMBIA1301序列中β-葡萄糖醛酸酶和诺帕林合成酶终止子(GUS-NOS) 3个片段构建重组质粒(pAtICL)和水稻异柠檬酸裂解酶(OsICL)的编码序列(AK063353, KOME克隆号001-114-C03)。首先，DNA片段OsICL编码序列是用濒死经历我利用引物在5 '端限制位点濒死经历I_OsICL_F和OsICL_R(附加文件4)，克隆到pTZ57R/T之前，使用氨苄西林平板上的蓝白色菌落筛选，TA克隆质粒(Thermo Fisher，美国)，得到OsICL -pTZ57R / T。pAtICL序列是由Xba我和濒死经历我使用引物限制位点XbaI_pAtICL_F和pAtICL＿濒死经历I_R(附加文件4)，并克隆成OsICL -pTZ57R / T的Xba我和濒死经历我限制的网站。结果pAtICL-OsICL-pTZ57R/T经EcoR我和Xba一、GUS-NOS片段被设计EcoR我和XbaI利用引物限制位点;EcoRI_DTOPO_GUS-NOS_F和GUS-NOS_XbaI_R(附加文件4)，然后克隆到pAtICL-OsICL-pTZ57R/T，得到重组质粒GUS-NOS-pAtICL-OsICL-pTZ57R / T。然后是一盒GUS-NOS-pAtICL-OsICL用DTOPO_GUS-NOS_F和OsICL_R引物(附加文件4)．的GUS-NOS-pAtICL-OsICL将该片段插入到pENTR/D-TOPO gateway定向克隆质粒(Invitrogen™，美国)中。GUS-NOS-p卡带AtICL-OsICL利用LR克隆酶II (Invitrogen公司，美国)通过Gateway克隆法将pENTR/D-TOPO克隆到pK2GW7载体上。设计该重组质粒用于表达OsICL在本机AtICL启动子。另外两个质粒被设计成过表达OsICL而且OsCam1-1都是用OsICL片段，利用引物DTOPO_在起始密码子前加入CACCOsICL_F和OsICL_R(附加文件4)．将该片段定向克隆到pENTR-DTOPO载体中，再通过Gateway克隆到pK2GW7载体中。因此,OsICL应该由pK2GW7载体上的35SCaMV启动子驱动。重组质粒GUS-NOS-p的DNA序列AtICL-OsICL -pK2GW7(附加文件5),牛OsICL -pK2GW7(附加文件6)测定。根癌土壤杆菌用单个质粒转化GV3101，用于浸花[41)的Aticl拟南芥突变体产生表达拟南芥株系OsICL在2138 bp的上游序列下AtICL(3 fl9), overexpressingOsICL(牛OsICL/icl)．农也被OXOsICL -pK2GW7，用于WT拟南芥的花浸渍产生OsICL(牛OsICL/ WT) overexpressing线。

选取T1拟南芥种子，在1% w/v蔗糖MS + 50 ~ 100 μg/ml卡那霉素的培养基上进行培养。每个T1植株在卡那霉素下萌发30-100粒种子，测定T2种子的成活率。无对偶基因的半合子T2的预期存活率为75%。的χ2进行检验，并确定统计学意义为p

基因组DNA是通过在1.5毫升的微管中使用密炼机MM 400 (Retsch，德国)研磨植物叶片(约100毫克)来提取的。然后取含200 mM Tris缓冲液(pH 7.5)、25 mM EDTA、250 mM NaCl和0.05% w/v SDS的植物基因组提取缓冲液300 μl与样品混合。在样品混合物中加入等体积的99%异丙醇，混合。12,000×g离心15 min，弃上清。将球团在室温下干燥约15分钟或直到异丙醇完全蒸发。加入50 μl灭菌蒸馏水使颗粒溶解。

采用LP、RP、LB三种引物进行PCR分型(附加文件)7)．LP和RP位于该基因上，LB位于At第4外显子插入的T-DNA上ICL(附加文件8)．在不插入T-DNA (WT)的拟南芥中，LP和RP引物的PCR产物约为911 bp，而在插入T-DNA的拟南芥中，LB和RP引物的PCR产物约为500 bpAtICL（Aticl突变体)。插入突变体的T-DNA足够长，可以阻止使用LP和RP引物进行PCR扩增。在杂合子植株中，期望得到两个911 bp和500 bp左右的PCR产物;因此，还需要再选一代纯合子植株，获得突变体供进一步实验。

采用特异性引物OsICL_Seq_M3_F的PCR基因分型(附加文件7)，位于的编码区OsICL和35S_Terminator_Seq_R(附加文件7)进行确认OsICL插入到转基因拟南芥中。转基因拟南芥的PCR产物大小OsICL预计约为460 bp。

拟南芥株系3FL9、OX的叶片组织总量约为50 mgOsICL/icl,牛OsICL/ WT,Aticl从3个生物重复中收集突变体和WT，在1% w/v蔗糖MS培养基中生长10天，在液氮中冷冻，并用密炼机研磨成细粉。然后，提取缓冲液500 μl (100 mM磷酸钾缓冲液，pH 7.6, 10 mM MgCl)2， 1毫米EDTA和1毫米DTT) [22]加入到地面样品中，通过涡流混合。4℃，12,000×g离心20分钟。上清液转移到新的微管中作为粗蛋白提取液用于酶活性测定，颗粒被丢弃。

然后，将提取的蛋白50 μl加入到含有50 mM磷酸钾缓冲液的440 μl反应缓冲液中，pH为6.9,50 mM MgCl2、10 mM EDTA和40 mM苯肼，由Cooper和Beevers [15]，然后用移液管在路径长度为1厘米的1毫升夸脱试管中，在30°C混合。反应混合物在A处的吸光度324用分光光度计测定，待其稳定后，加入500 mM D-L异柠檬酸10 μl，混合均匀。然后，反应混合物在A处的吸光度324测量10分钟。0分钟和10分钟之间的差A324数值用来计算每10分钟的乙醛酸产量，使用乙醛酸标准曲线。在96孔板上，用Bradford试剂测定粗蛋白提取物馏分的蛋白质含量。吸光度的595使用酶标仪Synergy H1 (Biotek®，美国)进行测量，并使用牛血清白蛋白构建标准曲线。

拟南芥5个系的种子;3 fl9,牛OsICL/icl,牛OsICL/ WT,Aticl对突变体和WT进行如上去污处理。然后，将种子依次播种在NaCl浓度为0、100、120、150或200 mM的MS培养基上。拟南芥平板在4℃保存2天。移入生长环境后，每天观察萌发种子的数量，持续7天。我们进行了5个生物重复，每个生物重复包含每个品系的50粒种子。发芽率以百分数表示，并以标准差表示。

随着这些植物的生长步骤，生长期延长到10天。然后，每个生物复制10株幼苗Aticl拟南芥突变体和WT, 3FL9, OXOsICL/icl,牛OsICL称取鲜重/WT，测定鲜重。然后将样品放入热风烘箱中，60-70°C烘烤5-7天。将烤好的样品称量以确定干重。

拟南芥株系3FL9、OX的4周营养期OsICL/icl,牛OsICL/ WT,Aticl在泥炭苔藓:珍珠岩:蛭石配比为3:1:1的花盆中生长，用300 mM NaCl处理3天。然后允许黑暗适应30分钟前Fv/ F米在黑暗条件下使用袖珍PEA荧光计(Hansatech，英国)进行测量。莲座叶温度测量采用前视红外C2热像仪(FLIR，美国)。为Fv/ F米， 4个生物重复，叶片温度6个生物重复。

拟南芥株系3FL9、OX的4周营养期OsICL/icl,牛OsICL/ WT,Aticl在6个生物重复的泥炭苔藓:珍珠岩:蛭石3:1:1的花盆中生长，用300 mM NaCl处理3天。采集莲座叶，液氮冷冻，冻干。测量干重，将样品磨成细粉。样品用去离子水提取并过滤。采用高效液相色谱(HPLC)(日本岛町)和Hi-Plex Ca (Duo)柱(Agilent，美国)测定葡萄糖、蔗糖和果糖的含量。HPLC流速为0.25 ml/min，柱温为85°C，以100%超纯水为流动相，采用折射率检测器(RID)检测糖。

q rt - pcr、酶活性测定和生长参数数据的比较采用方差分析(ANOVA)，平均值与Duncan多重极差检验进行比较，显著性设为pp