膜蛋白分离的方法和原理 |
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1、分离膜蛋白的方法(原则性): 1) 先分离膜,然后提取;如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎,然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。(例如:michael11液氮研磨组织,加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收集37%与41%间的成分,即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白 ) 2 )用特殊的去污剂选择性的分离。 从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下,都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来,然后将蛋白质稳定.去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定,但在某些情况下,还要考虑到以后的纯化步骤.虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化,但最终仍可能需要除去去垢剂.这常常会引起蛋白质失活,但如果蛋白质是用于测序的,他将不是一个问题.如果不是用于测序的,可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中,都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而,他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时,必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如 triton X-100在280nm处有吸收,如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关,就应避免使用这类去垢剂. 将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后,再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白,而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白,无论在种类上还是数量上,都比酸溶解法所得到的蛋白( |
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