引物设计是PCR实验的必备步骤，PCR实验的成功与否跟引物设计有很大的关系。

如何设计高质量的引物是从生物研究的小白到大牛都必须关注的。

图1. PCR扩增原理图      美格生物

1. 用于PCR反应的引物需要两条，分别设在被扩增目的的片段的两端，并分别与模板正负链序列互补，避免出现二聚体、发夹结构等

2. 引物的长度一般以18-25个核苷酸为宜，特殊情况下可适当增加，引物过长容易产生寡核苷酸的链内互补，形成发卡状结构，影响引物与模板之间的互补；

3. 两条引物之间尤其在3’端的序列不能有互补，以免形成引物二聚体；

4. 引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积；引物GC含量通常选择40%-60%之间，以保证引物的高效性

5. PCR扩增中的退火温度是根据引物的Tm值而决定的，两条引物的Tm值不能差太大；

6. 根据需要，可在合成引物时于其5’端加修饰成分。

7. 应选择特异性的引物，避免与非目标序列发生反应。

1. 引物长度

一般引物长度为18~30碱基。教科书要求15-30bp，常用为20bp左右。实际情况最好是18-24bp，以保证特异性，不是越长越好，太长的引物同样会降低特异性，并且降低产量 。

决定引物退火温度最重要的因素就是引物的长度。引物的退火温度一般选择引物的（Tm值-5℃），有的直接用Tm值。

2. 退火温度

退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。

如何计算引物的退火温度？

美格君建议参考以下公式，可以用于粗略计算引物的退火温度。

在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外，有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。在利用软件设计引物的时候，可以通过TM值反过来决定引物的长度，特别是荧光定量PCR的引物，要控制TM=60℃左右。

总的说来，每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

3. 引物扩增跨度

以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

4. 引物碱基和GC含量

G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。5'端和中间序列要多GC，以增加稳定性，避免3'端GC rich， 最后3个碱基不要有GC，或者最后5个有3个不要是GC。

GC含量：

一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。

5. 引物的二级结构

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

避免扩增模板的二级结构区域。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。

6. 引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

7. 引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

8. 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

9. 学会使用软件：PP5，Oligo6，DNAstar，Vector NTI，primer3（这个在线设计最好用）。

10. 与靶DNA的错配

当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。选择Align two sequences (bl2seq)。

将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。如果知道序列在数据库中的GI号也可以直接输入GI号，这样就不用粘贴一大段的序列了。最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多个同源位点了。

11. 引物末端

引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。使用兼并引物时, 要参考密码子使用表，注意生物的偏好性，不要在3'端使用兼并引物，并使用较高的引物浓度(1uM-3uM) 。

12. 添加标记或者位点

5’端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的让步。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。

13. 亚克隆

很多时候PCR只是初步克隆，之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。

如何进行亚克隆？

亚克隆所要设计的序列。

A 添加限制性内切酶酶切位点

添加酶切位点是将PCR产物进行亚克隆使用得最多的手段。一般酶切位点是六个碱基，另外在酶切位点的5’端还需要加2～3个保护碱基。但是不同的酶需要的保护碱基数目是不相同的，例如：SalⅠ不需要保护碱基，EcoRⅤ需要1个，NotⅠ需要2个，Hind Ⅲ 3个。

B LIC添加尾巴

LIC的全称是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司专门为其部分的pET载体而发明的一种克隆方法。用LIC 法制备的pET 载体有不互补的12–15 碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。扩增目的插入片段的引物5'序列要与LIC载体互补。T4 DNA 聚合酶的3'→5'外切活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速高效，而且为定向克隆。

C 定向TA克隆添加尾巴

TA克隆无法将片段定向克隆到载体中，所以后来Invitrogen推出了可以定向克隆的载体，它的一端含有四个突出的碱基GTGG。因此在PCR引物设计时也要相应的加上与之互补的序列，这样片段就可以“有方向”了。

如果你时间比较紧，可以尝试直接合成，把基因和载体一起合成，擎科把这个叫做ET基因合成。

D In-Fusion克隆方法

不需连接酶，不需长时间的反应。只要在设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列，然后将PCR产物和线性化的载体加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室温下放置半个小时就可以进行转化了。这种方法特别适合大批量的转化。

14. 兼并引物

有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少兼并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用兼并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多兼并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。

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