9、当基因存在多个转录本时，最好将sgRNA设计在同源区域。

二、sgRNA的设计

1.NCBI获取基因信息，选择编辑区域

在NCBI主页Gene界面输入基因名称搜索对应的基因。此处以人类KAT7基因为例；

2、点击search后，滚动至“基因组区域、转录本和产物”区域，将能够观察到该基因具有多个转录本，其中竖立的绿色方框表示外显子，每个转录本所共有的方框即为同源区。随后，点击GenBank；

3、下载序列，用snapgene打开，即可查看每个同源区对应的具体碱基序列；

4. 滑动网页至mRNA和蛋白质(s)位置，点击以NM开头的链接即可进入相应转录本的序列，不同NM的条目则表示该基因存在不同的转录本；

5、点击，下载转录本序列，用snapgene打开；

6、snapgene打开全长序列，找到所有转录本的共外显子。竖立的方框是外显子，在敲除过程中，目标是最大程度地削减KAT7蛋白的表达，以确保转录本的各个亚型均无法表现，因此，应当有针对性地删除这些亚型共享的基因区域，且最佳选择是尽可能靠近CDS区的ATG起始密码子；

7、在转录本序列中查找共外显子序列，找到共外显子所对应的外显子在转录本上的位置，并做出特殊标记；

8、复制那段外显子的序列到sgRNA设计网站，http://crispor.tefor.net/（网站有很多）；

9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列，选择正确的物种和Cas9蛋白；

10、网站生成的sgRNA序列信息如下，包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息（建议sgRNA设计3-4条，利于高效完成）；

11、设计好的引物送引物公司设计合成。

注意：sgRNA的设计严格按照设计原则进行，需考虑所有候选靶点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点。

三、sgRNA质粒的构建方法

1、酶切载体

LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点，通过使用BsmB内切酶I，我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书，随后进行胶切、回收并备用。

2、寡核苷酸链引物退火

体系：

退火参数：

37℃ 30 分钟，95℃ 5 分钟，然后以每分钟降低5℃的速度将温度降到25℃

3、连接

体系：一般室温放置20-30分钟（NEB的快速T4连接试剂盒）

4、质粒转化：

①从-80℃存储的Stbl3感受态细胞中取出并解冻，将5-10µL连接产物轻柔吹混匀后加入感受态细胞，接着在冰上孵育30分钟；

②冰上孵育后，将感受态细胞放入预调至42℃的水浴锅中进行90秒的热激，然后返回冰上孵育10分钟；

③加入500 μL预热至室温的LB培养基，将混合物置于37℃摇床中摇菌30分钟；

④以3000 r/min离心3分钟，弃掉上清，利用冷却至室温的玻璃棒涂布培养皿（AMP抗性），随后在37℃培养箱中过夜生长。

5、挑取单克隆，摇菌，菌落PCR。

6、对PCR生成物进行琼脂糖凝胶电泳，运用凝胶成像仪进行成像，并挑选阳性菌落将其送往测序公司进行测序鉴定。

7、基于测序结果挑选目标菌落进行扩大培养，提取质粒以备用于后续实验室实验。 返回搜狐，查看更多