·基础研究·

洪 岭， 伍园园， 唐传玲， 陈淼鑫， 赵 美， 滕晓明

(同济大学附属第一妇婴保健院生殖医学中心，上海 201204)

【摘要】目的 探讨IL-6在多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)高胰岛素血症和胰岛素抵抗中的作用。方法 在体外培养的大鼠胰岛细胞培养液中加入10、100和1000pg/ml IL-6，于培养24、48、72h后，采用放射免疫法检测IL-6对胰岛细胞胰岛素分泌的影响。结果 培育48h时，1000pg/ml IL-6板孔中的胰岛素浓度高于对照组，差异有统计学意义(PP

【关键词】白介素6； 多囊卵巢综合征； 胰岛素抵抗； 胰岛

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是一种复杂的生殖内分泌疾病，近期危害有月经失调、不孕、多毛、痤疮、肥胖等，易并发子宫内膜癌、糖尿病、动脉粥样硬化、冠心病等远期并发症。PCOS虽然常见，但其发病机制至今尚未完全阐明。近年来，许多文献发现，一些炎症因子浓度，如IL-6、TNF-α、CRP等在PCOS患者体内常常高于非PCOS患者[1-5]。这些炎症因子与PCOS的发病机制的关系是研究热点之一。本研究对大鼠胰岛细胞进行体外原代培养，观察IL-6对胰岛细胞胰岛素分泌的影响，探讨IL-6在PCOS发生、发展中的作用。

1.1 试剂与仪器

IL-6购自ProSpec公司；RPMI-1640培养基购自Hyclone公司；胶原酶V、DTZ购自Sigma公司，Ficoll 400购自Pharmacia公司，胎牛血清购自杭州四季青公司;大鼠胰岛素放射免疫测定试剂盒购自Linco公司;36%乙酸溶液购自上海化学试剂公司；戊巴比妥钠购自上海西唐生物科技有限公司。

二氧化碳细胞培养箱购自Thermo公司；TE2000倒置荧光显微镜购自Nikon公司；解剖显微镜购自上海勤奋仪器厂；γ放射免疫计数器(GC-911)购自中国科技大学中佳公司。

1.2 大鼠原代胰岛细胞培养体系的建立

将大鼠以3%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后，皮肤碘伏消毒后，作腹正中切口，显露肝门，切除剑状软骨。用棉签将大鼠小肠推至腹腔左侧，暴露胆管远端。在胆总管入十二指肠稍上方处用 4-0 丝线结扎胆总管末端，近段于肝门处同样结扎，于近段结扎处稍下方用2号针头将胆总管刺一小口，将自制软导管(用中号黄色枪头，在酒精灯上过火拔丝而成)沿该小口插入胆总管，向前插入约1cm(图1A)。将大鼠心脏剪破，尽量放出体内血液。将10ml含0.5g/L V型胶原酶溶液从导管缓慢注入胰管内(图1B)，使胰腺膨胀(图1C)。迅速完整摘取胰腺，去除胰腺周围的结缔组织，置于含适量Hank’s液的锥形瓶中，38℃水浴14min，取出剧烈振荡1min,分散胰腺，使呈细沙状，加入胎牛血清终止消化。不锈钢丝网(28目)过滤，离心半径10cm，1000r/min，离心1min，倒掉滤液后，以Hank’s液洗2遍后，用25% Ficoll 4ml将离心沉淀混匀，逐渐加入23% Ficoll 2ml，20% Ficoll 2ml，11% Ficoll 2ml，Hank’s液2ml。4℃，离心半径16cm，3000r/min,离心20min，吸出11%～20%、20%～23%界面的细胞，经培养液洗涤2次，弃上清液，收集胰岛(图1D)。将获取的胰岛置入含10%胎牛血清的1%双抗培养基内，采用0.04%台盼蓝进行染色，活力>70%。按每孔20个胰岛(在解剖显微镜下吸取)加入到24孔培养板。

图1 原代大鼠胰岛分离过程Fig.1 The separation of rat pancreatic isletsA： 灌注前的胰腺；B： 灌注中的胰腺；C： 灌注后的胰腺；D： 胰岛(DTZ染色)

1.3 不同浓度的IL-6与胰岛细胞的共培养

在培养板的板孔中分别加入IL-6，使其终浓度分别为0、10、100、1000pg/ml，0pg/ml为空白对照组，每种浓度梯度均作3复孔。细胞接种于37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度95%培养箱中，在24、48、72h 3个时间点收集板孔中的上清液150μl，离心半径16cm，3000r/min,离心10min，离心后的细胞上清液放入冰箱中冷冻保存(-20℃)。

1.4 放射免疫法测定胰岛素浓度

按照试剂盒说明书： 将标准品100μl、已经进行 125I标记的大鼠胰岛素100μl、大鼠胰岛素抗体100μl进行混合。然后，在4℃环境中孵育24h。将沉淀剂 1ml 加入后，离心半径 15cm，4000r/min，离心20min。将上清液丢弃，试管沥干，通过γ记数器进行检测。批内标准曲线误差

1.5 统计学处理

应用SPSS 16.0软件进行统计学分分析，数据以表示。根据球形检验(Mauchly’s Test of Sphericity)结果判断重复测量数据之间是否存在相关性，若P>0.05，提示重复测量数据之间没有相关性，进行单因素方差分析检验；若PP

培育48h时，1000pg/ml IL-6板孔中的胰岛素浓度高于对照组，差异有统计学意义(PP

表1 IL-6刺激下大鼠胰岛细胞所分泌的胰岛素与对照组的比较

Tab.1 Insulin level in supernatant of rat pancreatic islet cell cultured with various concentrations of IL-6

IL-6/(pg·ml-1)24h胰岛素/(ng·ml-1)48h胰岛素/(ng·ml-1)72h胰岛素/(ng·ml-1)01.083±0.1531.383±0.1481.803±0.162101.134±0.1331.418±0.1241.942±0.1711001.197±0.1231.484±0.1422.017±0.190*10001.207±0.1381.555±0.140*2.131±0.184*

与对照组相比，*P

图2 IL-6刺激下胰岛细胞胰岛素的分泌情况Fig.2 Insulin secretion in pancreatic islet cells treated with various concentrations of IL-6与对照组相比，*P

IL-6是机体细胞因子网络中的重要成员。它既是免疫调节因子，又是炎症介质，有多种调节作用。可通过自分泌和旁分泌而作用于组织细胞，刺激细胞生长，促进细胞外基质增生，参与炎症反应等。

2014年，Xu等[1]在一项meta分析中指出，许多PCOS患者表现为胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)、高雄激素血症和IL-6浓度增高，且IL-6增高与IR和高胰岛素血症具有密切联系[6]。研究报道了PCOS患者IL-6基因启动子的多态现象与发病有关。IL-6受体是由gp130和gp80和两个亚基构成的异二聚体。Escobar-Morreale等[7]调查了88例PCOS患者及45例正常女性，发现PCOS患者gp130基因上Gly148Arg基因型频率高于正常对照组(0.17 vs 0.08，P=0.038)。以上发现均提示IL-6 与IR和PCOS发病机制密切相关，推测IL-6等炎症因子可能首先导致IR，代偿性引起高胰岛素血症，继而由高胰岛素血症引起PCOS的发生。

IL-6导致IR的可能机制为： 因为炎症信号传导通路与胰岛素受体信号通路存在一定的交叉，IL-6 可干扰胰岛素IRS/PI3-K(胰岛素受体底物/磷脂酰肌醇-3-激酶)信号传导通路，这是导致IR的主要分子机制，具体主要是通过IKK-IκB-NFκB通路来完成。IL-6首先激活IKK，引起IKB磷酸化并与NF-κB解离，导致NF-κB发生活化。IKK是胰岛素受体和受体底物的丝氨酸磷酸化激酶，可使胰岛素受体底物307位的丝氨酸发生磷酸化，正常酪氨酸磷酸化受到抑制，从而减弱了胰岛素受体与受体底物的结合，终止INS信号向PI3-K方向的传导，导致3-磷酸肌醇依赖的蛋白激酶(PDK)、蛋白激酶B(PKB/Akt)等活性下降，葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)跨膜转位减少、糖原合成减少，引起高胰岛素血症和IR。另外，IL-6还可以通过激活c-Jun氨基末端激酶通路、细胞因子信号转导抑制因子、蛋白激酶C、一氧化氮合成酶等通路引起IR。

本研究发现，在体外培养的原代大鼠胰岛细胞中加入炎症因子IL-6，具有直接促进胰岛素分泌的作用，其机制可能与IL-6可激活胰岛素分泌信号途径中的某些环节有关。

【参考文献】

[1] XU X, DU C, ZHENG Q, et al. Effect of metformin on serum interleukin-6 levels in polycystic ovary syndrome： a systematic review[J]. BMC Womens Health, 2014,14： 93.

[2] PEDROSO D C, MIRANDA-FURTADO C L, KOGURE G S, et al. Inflammatory biomarkers and telomere length in women with polycystic ovary syndrome[J]. Fertil Steril, 2015,103(2)： 542-547.

[3] SAHIN F K, SAHIN S B, BALIK G, et al. Does low pentraxin-3 levels associate with polycystic ovary syndrome and obesity?[J] Int J Clin Exp Med, 2014,7(10)： 3512-3519.

[4] PAWELCZAK M, ROSENTHAL J, MILLA S, et al.Evaluation of the pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor-α in adolescents with polycystic ovary syndrome[J]. J Pediatr Adolesc Gynecol, 2014,27(6)： 356-359.

[5] TARKUN I, CETINARSLAN B, TÜREMEN E, et al. Association between circulating tumor necrosis factor-alpha, interleukin-6, and insulin resistance in normal-weight women with polycystic ovary syndrome[J]. Metab Syndr Relat Disord, 2006,4(2)： 122-128.

[6] ESCOBAR-MORREALE H F, LUQUE-RAMIREZ M, SAN MILLAN J L. The molecular-genetic basis of functional hyperandrogenism and the polycystic ovary syndrome[J]. Endocr Rev, 2005,26(2)： 251-282.

[7] ESCOBAR-MORREALE H F, CALVO R M, VILLUENDAS G, et al. Association of polymorphisms in the interleukin 6 receptor complex with obesity and hyperandrogenism[J]. Obes Res, 2003,11(8)： 987- 996.

IL-6 induces insulin secretion in rat pancreatic islet cells in vitro

HONG Ling, WU Yuan-yuan, TANG Chuan-ling, CHEN Miao-xin, ZHAO Mei, TENG Xiao-ming

(Reproductive Medicine Center, Shanghai First Maternity and Infant Hospital, Tongji University, Shanghai 201204, China)

【Abstract】Objective To investigate the effect of interlukin-6 (IL-6) on insulin secretion in rat pancreatic islet cellsin vitro. Methods Primarily cultured pancreatic islet cells were treated with IL-6 at concentration of 10, 100 and 1000pg/ml, respectively. The insulin contents in culture supernatant were detected by radioimmunoassay (RIA) at 24, 48 and 72h after culture. Results The insulin levels in culture supernatant with IL-6 1000pg/ml at 48h after culture were significantly higher than those in controls (Pin vitro, which may be associated with hyperinsulinemia and insulin resistance involved in polycystic ovarian syndrome.

【Key words】interlukin-6; polycystic ovary syndrome; insulin resistance; pancreatic islet

doi：10.16118/j.1008-0392.2017.01.008

收稿日期：2016-11-14

作者简介：洪 岭(1978—)男，主治医师，博士.E-mail： [email protected]

通信作者：滕晓明.E-mail： [email protected]

【中图分类号】R 711.6

【文献标志码】A

【文章编号】1008-0392(2017)01-0040-04