如果水相完全去除并向样本中加入乙醇，乙醇会因密度较低而位于TRIzol试剂的上方。如果未充分混合酒精及有机相就对样本进行离心，则在离心后乙醇位于TRIzol试剂的上方，DNA仍处于中间相，而TRIzol试剂位于底部的红色有机部分。如果没有恰当混合乙醇，则应继续混合样本，然后离心并继续完成DNA分离实验方案中的步骤1。

如果不慎加入了70%乙醇，则可能在有机相上方出现小体积的水相。由于实验方案所用洗涤液含有不超过30%的水，因此，在有机相上方出现的水层不会超过0.3mL的30%（90 µL）。您可在继续分离前尝试去除水相，但是DNA得率可能会降低。

如果在RNA分离过程中出现水相与有机相分离不完全，也会出现这种情况，原因主要有四个：1，氯仿混合不充分；2，样本离心时转速不合适；3，未达到需要的离心时间，4，离心温度错误。这些原因导致最终将从样本中回收到明显少于600 µL的RNA水相。液相分离问题通常出现于使用涡旋振荡来混合试管中的氯仿时。由于TRIzol试剂和有机相之间较大的密度差异，这些溶液很难完全被混匀，因此只能回收部分水相。当加入乙醇并再次充分混合样本时，将再次出现水相和有机相的分离，并且水相会出现于样本上方。