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DNA,即脱氧核糖核苷酸,储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础,生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。研究DNA一直是分子生物学、遗传学等热门领域的热点,所以提取DNA亦成为实验中不可或缺的一环。常见的DNA提取方法有CTAB法、SDS法、吸附柱法、磁珠法。其他的方法还有物理方式如玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。化学方式如异硫氰酸胍法、碱裂解法。生物方式:酶法。 CTAB法提取DNACTAB(Cetyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,能与核酸形成复合物,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,但不会沉淀核酸。再通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后,加入乙醇沉淀,即可使核酸分离出来。CTAB方法主要应用于植物基因组DNA的提取。 CTAB抽提缓冲液配方:2%CTAB,100mmol/L Tris-HCI( pH 8.0),20 mmol/L EDTA,1.4mol/L NaCI。有些植物富含多糖多酚,会添加不同浓度的β-巯基乙醇,通常为2%。 CTAB法提取RNA步骤(该流程仅为CTAB法其中一种,实验时可根据不同材料加以改进,以获得最佳实验结果): 1) 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。 2)取少量实验材料(约300mg)置于研钵中,用液氮磨至粉状; 3) 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液,轻轻搅动; 4) 将磨碎液分倒入1.5ml的灭菌离心管中,磨碎液的高度约占管的三分之二; 5)置于65℃的水浴槽或恒温箱中,每隔10min轻轻摇动,30~60min后取出; 6)冷却2min后,加入氯仿-异戊醇(24:1)至满管,剧烈振荡2~3min(若提取的是总基因组,则不能剧烈震荡。),使两者混合均匀; 7)放入离心机中10000rpm离心10min,与此同时,将600ul的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中; 8) 10000rpm离心1min后,移液器轻轻地吸取上清夜,转入含有异丙醇的离心管内,将离心管慢慢上下摇动30sec,使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物; 9)10000rpm离心1min后,立即倒掉液体,注意勿将白色DNA沉淀倒出,将离心管倒立于铺开的纸巾上; 10)60sec后,直立离心管,加入720ul的70%乙醇及80ul 5 M的醋酸钠,轻轻转动,用手指弹管尖,使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中; 11)放置30min,使DNA块状物的不纯物溶解; 12)10000rpm离心1min后,倒掉液体,再加入800ul 70%的乙醇,将DNA再洗 30 min; 13)10000rpm离心30sec后,立即倒掉液体,将离心管倒立于铺开的纸巾上;数分钟后,直立离心管,干燥DNA(自然风干或用风筒吹干); 14)加入50ul 0.5 × TE(含RNase)缓冲液,使DNA溶解,置于37℃恒温箱约15h,使RNA消解。 CTAB法中各试剂的作用: 1)Tris-HCL(pH8.0):提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏; 2)EDTA:螯合Mg2+或Mn2+,抑制DNase活性; 3)NaCl:提供高盐环境,使DNA充分溶解; 4)CTAB:裂解细胞,沉淀蛋白和中性多糖; 5)β-巯基乙醇:抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除; 6)氯仿:变性剂,抽提脂溶性物质; 7)异戊醇:去除气泡;有助于分相(使离心后水相、有机相稳定); 8)异丙醇:沉淀DNA; 9)NaAc:促进DNA沉淀; 10)70%乙醇:洗涤DNA(盐、蛋白等溶于70%乙醇,而DNA不溶); 11)95%乙醇:沉淀DNA,也可使DNA快速干燥; 12)乙烯吡咯烷酮(PVP):酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。 SDS法提取DNASDS(十二烷基苯磺酸钠)是一种阴离子去垢剂,在高温(55-65℃)条件下能裂解细胞,使染色体离析、蛋白变性,同时SDS与蛋白质和多糖结合成复合物,释放出核酸。提高盐浓度并降低温度(冰浴),使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全,离心后去除沉淀,上清液中的DNA用异戊醇/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。该方法操作简单、温和,也可提取到高分子量的DNA,但得到的的产物含糖类杂质较多。 主要应用于动物组织、血液、细胞、细菌和酵母等基因组DNA的提取。 SDS法提取基因组DNA操作流程(该流程仅为SDS法其中一种,实验时可根据不同材料加以改进,以获得最佳实验结果): 1)取1-2g实验材料用液氮研磨至粉末状,转移粉末到加有500ul提取液的离心管中,轻轻混匀; 2)向离心管中加入50ul 20%SDS溶液,混匀,不可过于强烈振荡以防基因组DNA断裂,65℃保温10min,并不时摇动; 3)加入150ul 5M KAc,混匀,置于冰上20-30min; 4)4℃,15000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中,加入0.7V的异丙醇,混匀,-20℃沉淀30min; 5)12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀,吹干后加入适量的灭菌水或TE溶解DNA; 6)加入1/10体积的RNaseA,37℃保温20min,除去RNA; 7)氯仿抽提后,加入2V乙醇,-20℃沉淀30min。12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀; 8)用400ul 70%乙醇洗涤一次后吹干,加入适量灭菌水或TE溶解DNA。 SDS法中各试剂的作用: 1)Tris-HCL(pH8.0):提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏; 2)EDTA:螯合Mg2+或Mn2+,抑制DNase活性; 3)NaCl:提供高盐环境,使DNA充分溶解; 4)SDS:裂解细胞,使蛋白变性,染色体离析; 5)β-巯基乙醇:抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除; 6)KAc:K+置换SDS的Na+,形成不溶于水的PDS,将大量蛋白同步沉淀; 7)氯仿:变性剂,抽提脂溶性物质; 8)异戊醇:去除气泡;有助于分相(使离心后水相、有机相稳定); 9)异丙醇:沉淀DNA; 10)70%乙醇:洗涤DNA(盐、蛋白等溶于70%乙醇,而DNA不溶); 11)95%乙醇:沉淀DNA,也可使DNA快速干燥。 由于篇幅过长,将分期讲述《基因组DNA提取那些事》, 下期内容:吸附柱法提取DNA、磁珠法提取DNA等。 |
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