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作者：

吕虹

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摘要：

目的针对KPC和NDM-1介导的碳青霉烯类耐药,建立实时荧光PCR检测方法,并研制出检测试剂盒,用来快速,准确,灵敏的检测携带blaKPC基因,blaNDM-1基因的耐药菌株. 方法基于复合探针技术原理,以blaKpC,blaNDM-1序列作为待检靶基因,分别找到它们的基因保守区来设计引物,探针,建立PCR体外扩增方法,通过荧光信号的变化来检测细菌耐药基因(blaKPC blaNDM-1).为提高灵敏度和扩增效率,获得最佳检测结果,试验了包括甲酰胺浓度,MgC12浓度,引物浓度,探针浓度,荧光探针与淬灭探针的比例,Taq酶的用量,退火温度,退火时间,核酸提取方法,样本类型,适用机型等因素对扩增的影响.并对试剂盒准确性,灵敏度,精密度等各项指标进行评估. 结果细菌耐药基因blaKpC实时荧光PCR检测方法适用于Roche Light Cycler2.0,Roche480,ABI7500,Bio-Rad CFX-96等荧光PCR仪器.在Roche Light Cycler2.0荧光PCR仪器(20μ1体系)上反应液各成份用量确定为:3%甲酰胺,3.5mmol/L Mg2+浓度,1.0mmol/L dNTPs混合溶液,0.5μmol/L KPC上下游引物,0.2μmol/L KPC荧光探针,0.4μmol/L KPC淬灭探针,0.15μmol/L内对照引物,0.06μmol/L内对照探针,1.5U/20μ1体系Hotmaster Taq酶,0.1U/20μ1体系UDG酶,内对照模板浓度为1.0×104cfu/ml.反应条件:50℃C2min;93℃2min;40个循环扩增(93℃5s,55℃20s,72℃5s);37℃10s.其他适用机型均采用30μ1体系,各成分用量和比例与20μ1体系的一致,反应条件:50℃C2min;94℃2min;40个循环扩增(94℃20s,55℃30s,72℃C10s);25℃10s.最佳样本提取方法为DNA提取液提取法.最佳样本用量为2μ1/20μ1体系或3μ1/30μ1体系. 细菌耐药基因blaKPC核酸检测试剂盒性能评估实验结果表明,检测方法的准确性,精密度良好,具有较高的灵敏度,对临床样本的检测下限可达到5cfu.对291例临床样本进行检测,其检测结果和测序结果对比,阳性符合率和阴性符合率均为100%,同时质控品的检测结果符合设计要求,质控品和所有临床样本的内对照均有荧光信号检出. 细菌耐药基因blaNDM-1实时荧光PCR检测方法及优化结果与细菌耐药基因blaKPc的基本一致. 细菌耐药基因blaNDM-1核酸检测试剂盒性能评估实验结果表明,检测方法的的准确性,灵敏度,精密度良好,对临床样本的检测下限可达到50cfu.对361例临床样本进行检测,其检测结果和测序结果对比,阳性符合率和阴性符合率均为100%,同时质控品的检测结果符合设计要求. 通过在实验室条件下的稳定性研究,得出2个试剂盒在37℃条件下的稳定期为24小时,在4℃条件下的稳定期为70天,在-20℃C条件下的稳定期至少为12个月,最多冻融4次. 结论所研制的细菌耐药基因(blaKPC blaNDM-1)核酸检测试剂盒的准确性,灵敏度,精密度等各项指标的验证结果均达到了设计要求,可快速有效检测携带blaKpC基因,blaNDM-1基因的耐药菌株,能够满足临床实际使用要求,具有较高的临床应用价值.适用于产KPC,产NDM-1细菌感染的定性检测,可为环境监测,卫生防疫及临床诊断工作提供一种有效的检测工具.

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关键词：

实时荧光PCR 复合探针 碳青霉烯类耐药 bla_(KPC)基因 bla_(NDM-1)基因

被引量：

2

年份：

2012