八十年代以来由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染而引起的艾滋病(AIDS)因其严重的危害性而受到人们高度重视，力争早期诊断和寻求有效治疗是防止其广泛传播的关键所在.聚合酶链反应(PCR)具有敏感、特异和快速的特点，是检测病毒、评价病情进展和探讨发病机理的有效工具.

一、HIV的基因结构

　　HIV的基因结构与其它逆转录病毒基本相同，为RNA双分子，其单链RNA分子由9749个核苷酸组成，有3组共9个基因。第一组为逆转录病毒共同的基因，即gag、pol和env基因，及侧翼的长末端重复顺序(LTR)等.

其中前三者为病毒的结构基因，编码病毒蛋白，而基因组两端的LTRs，不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性.第二组为调节基因表达的基因，即tat、rev和nef基因，可以增强或抑制其它基因的表达.

第三组为特有基因，负调控病毒的感染性，成熟或释放，即vif、vpu和vpr.HIV有十分高的遗传变异率，它是一个多态性病毒，从不同的AIDS患者体内分离出的病毒结构表现出一定的差异.

事实上，独立分离到的HIV-1和2彼此都不相同，这是由于病毒传播过程中突变，缺失或插入引起的，高度变异区在env基因内，相当于gp120的五个区段，gag和pol基因较少变异.

因此，只有选择病毒基因组中高度保守区域作为目的基因加以扩增，才能有效地检测所有HIV的变异性.目前已知HIV有两个型，HIV-1是从欧洲和美洲分离毒株的总称，亚洲地区的流行株也基本上为HIV-1，HIV-2是从西非的妓女分离的毒株.

二、PCR在鉴定HIV感染中的意义

　　HIV常可引起潜伏感染，但仍具有传染性，整合的病毒基因组在每个细胞中仅以很低的DNA拷贝数存在.

因此，需要建立一个敏感而又特异的HIV检测方法.传统的检测途经很多，包括外周血抗原测定，病毒分离和逆转录酶法等，但均费时费力，稳定性也差.核酸杂交虽有一定的特异性，敏感性却较低，利用原位杂交发现AIDS患者仅有104～105之一的细胞有含有HIV-1DNA，实际上远不至此.

聚合酶链反应被称为无细胞的分子克隆技术(cell-free molecular cloning)，自1987年即被用于AIDS的研究中.Ou利用针对HIV-1LTR，gag和env基因的三对引物对HIV血清学和病毒分离均阳性与血清学阳性.

但病毒分离阴性的男性同性恋者进行外周血单个核细胞(PBMC)前病毒DNA序列的测定，发现前者的阳性率为100%，后者也可达60%，对照组则均为阴性，因此提出PCR可以作为病毒分离的替代方法.

Imagawa将PCR与其他几种传统方法进行比较，结果在分离出HIV-1前，具有血清阳转的4例男性中3例可用PCR检测出外周血淋巴细胞中gag基因的存在，这种阳性反应可发生在血清阳转前38～42个月，而在得出PCR阳性结果前，无一例分离出病毒.

因而认为，对仍从事高危活动(如吸毒、同性恋等)的血清阳性个体，PCR能有效地发现HIV感染者的存在.此外，临床上AIDS患者常出现神经症状，而在许多血清学阳性个体的脑脊液(CSF)中却未分离出HIV-1，因而难以确定病毒的侵袭范围.

利用PCR技术已经证实了CSF中存在着前病毒DNA和游离病毒RNA序列，而且RNA量似乎比DNA更为丰富.至于CSF中病毒序列的存在是否与神经系统的损害有关，目前仍存在不同意见，但至少无症状感染者CSF中HIV-1的存在对阐明与HIV-1相关的神经损害具有重要意义.

　　研究表明，HIV感染的女性所生的婴儿中有30～59%可在宫内、分娩过程或产后哺乳期感染该病毒，但由于婴儿体内存在来自母体的抗体且可持续15个月左右，同时又缺乏检测IgM型抗体的手段等原因，使得传统方法在鉴定新生儿是否感染方面受到限制，及时地对新生儿作出诊断，对于其获得早期治疗具有积极的意义.PCR技术所需标本量少，对新生儿、婴儿的诊断尤为适用.

Roger用PCR对血清阳性母亲所生的23例儿童从新生儿开始进行外周血前病毒DNA的跟踪监测，结果表明，在后来发展为AIDS的7例儿童中，有5例在新生儿期即存在病毒序列，而血P24抗原却检测不到;具有AIDS非特异表现者，也有4/14在新生儿期呈阳性PCR反应;由这些母亲所生的健康儿童和阴性对照组则均为阴性，说明本方法的特异性和灵敏性极高.

Soeiro进一步用PCR法证实了宫内感染的存在，采集了23例AIDS或血清阳性母亲的流产儿组织，进行PCR扩增，并作原位分子杂交比较，结果有7例用PCR检测到HIV-1DNA，而原位杂交只有1/8流产儿组织呈阳性反应.

　　由于HIV具有高度的变异性，使得AIDS的治疗显得颇为棘手，现已发现体外病毒分离株对AZT易感性降低.Richman利用一对寡核苷酸引物对接受AZT治疗者的外周血进行PCR扩增，得到的535bp的片段中含有与AZT耐药性有关的4个逆转录酶基因突变位点，而且突变数目与耐药程度成比例。

因此，PCR能有效地监测毒株的耐药性.利用env基因的高度变异性，对该基因特异性扩增后进行病毒分型，对于监测毒株的变异及分子流行病学的研究具有十分积极的意义;对分娩健康婴儿的AIDS女患者HIV基因的扩增及分析，也有利于探讨母婴垂直传播的条件及毒株的特点，从而研制出有效的疫苗.

　　由此，我们可以看出，PCR技术在鉴定HIV感染方面具有重要的意义，它可检出抗体出现前的感染者，筛选新个体，确定病毒类型和耐药毒株，区分儿童感染的时间，并可作为AIDS的预后指征.

三、HIV感染的定量PCR研究

　　目前检测体内HIV活性的方法有限，虽然循环血CD4+细胞计数、血清P24抗原、新喋呤、β2-MG等曾用来指示HIV感染时病毒的水平，其敏感性和特异性均受限，定量培养又费时昂贵.定量PCR是HIV感染中直接测定病毒本身的最佳途径.早期首先采用有限稀释法，即将所采取的HIV感染者标本进行梯度稀释后分别进行PCR扩增，以反应阳性的最大稀释度

　　作为病毒水平，缺点是不能给出病毒的绝对拷贝数.后有作者用含有已知量的HIV序列的质粒DNA作为模板进行系列PCR反应，然后以扩增产物量对初始模板量得出标准曲线;待测标本用相同体系扩增后从标准曲线中求得所加标本量，从而推算出样品中HIV的感染水平.

但在反应过程中既使严格控制实验条件和操作步骤，同一份标本在不同的试管内也存在着扩增的差异，即所谓的“试管效应”，因此，为了使PCR定量客观标准化，又引入了内参照来消除这种差异，如利用HLADQα

基因与HIV感染标本用各自的引物在同一管中扩增，前者模板量已知，且作一系列梯度管，后者以一恒定的未知量参与反应，后用前者扩增的标准曲线来计算后者的初始模板水平，但缺点是这种内参模板的扩增效率与HIV的扩增效率不同.

　　从理论上讲，在PCR反应中应存在着这样一种关系，即Y=S(1＋e)n，Y指扩增后拷贝数，S是初始拷贝数，n代表循环次数，e指扩增效率.由于PCR对反应条件和初始模板量高度敏感，因此e值变异很大，可在0～1范围内波动，近年来在克服上述各种方法缺点的基础上而建立起来的竞争性定量PCR(QC-PCR)对HIV感染的定量分析已显示出广泛前景.

其基本原理是人工设计与待测靶序列基本相同但能够区分的突变体(包括缺失、插入和限制性酶切位点突变)作为竞争模板，并以不同比例与一定量的靶序列共同混合于同一反应体系中，在相同引物介导下，两种模板共同扩增，当某一管中两种扩增产物的量相等时，该管中的已知竞争模板浓度即为靶序列的初始模板浓度.

Piatak以HIV的高度保守区域gag基因作为靶序列，用含有HIV基因组的质粒为模板，设计引物用PCR方法合成一内部缺失80bp的gag片段，然后将此片段重组克隆后作为竞争模板.

与待测标本共同扩增后的产物由于分子量大小不同，可用琼脂糖、聚丙酰胺凝胶电泳及密度扫描等计数结果，从而确定起始模板数.该方法在目前而言是一种相对客观而准确的定量途经，但其缺点是每测一份标本需设系列管，比较麻烦，造价昂贵，试剂盒难于推广.

　　最近美国AcuGen System研制了一种新的封闭式定量PCR系统，将生化、计算机和光电技术相结合，并采用专用试剂，从扩增的DNA直接做定量数据的读取和分析，免除了传统的电泳，照相等步骤，也排除标本污染的可能性.设备由三部分组成，定量读数器，扩增仪和计算机.其定量模式是根据能量转换原理设计.

在PCR扩增到一定程度时，加入一信号试剂，即万能信号双链体，它是由互补的寡核苷酸链组成，该寡核苷酸链分别由具有荧光能量转换的供受者加尾修饰，连接在扩增引物的5'端，这种连接稳定了信号双链体，并建立了荧光能量转换反应，因为稳定结合在一起的双链体接受光后会发生能量转换.当以后的循环开始后，新生链开始产生。

引起这种结合的引物双链体变为单链，接受光的能力下降，发生能量转换的全部瓦解.荧光信号随着循环次数的减少而被测量出来，以计算特定扩增片段的不断累积量.目前国内已有这种HIV检测试剂盒出售，但由于设备及试剂均很昂贵，限制了它的广泛应用.

　　对体内的病毒水平作准确的定量分析，有助于对感染过程的各期作病因性分析，观察药物的疗效，更好地指导治疗.Bagnarelli用QC-PCR法检测33例HIV感染者外周血标本中病毒的拷贝数及转录情况。

结果提示，病毒拷贝数与疾病进展和CD4+淋巴细胞计数减少之间存在着与高度相关性，在疾病的各个阶段均存在着HIV-1结构基因的特异性转录和复制.有趣的是，尽管随着疾病的进展，病毒血症不断加重，但AIDS患者的个别感染细胞的转录活性仅中等度地高于无症状感染者.

此外，血浆中HIV-1基因组RNA定量，似乎是更为可靠和敏感的病毒活性的标志.另有作者用定量PCR发现AIDS患者血浆中HIV-1数量明显高于无症状血清阳性者，在每8～14周口服ddT剂量≥6.4mg/Kg.

天的患者，其血浆HIV-1颗粒数量明显降低，提示循环中游离病毒量与HIV-1的感染性滴度、CD4