在冷冻过程中会形成病毒内冰晶，这会增加产品的体积并可能损坏脂质双层，如上图1 所示。冰还会在冰和液体之间产生新的界面，并增加表面诱导聚集的风险。

在临界配方温度以上干燥会导致无定形相在冻干循环的初级干燥步骤中的流动性提高。这使得蛋白质相互作用并可以提高膜通透性。

作为二次干燥阶段的一部分去除每个水合壳的情况下，可能会发生蛋白质聚集和失活。在磷脂存在的情况下，热致相变的改变也可以提高膜渗透性。二次干燥直接影响残留水分含量，从而影响长期稳定性。

疫苗配方所需的特性

最佳情况下，疫苗必须在干燥状态下长期储存和液体状态下至少保持24 小时稳定。为了实现这一目标，必须以适当的配方和工艺开发疫苗。

图2.优先排除理论。

稳定剂（冷冻或冷冻保护剂）在开发稳定的疫苗配方中起着关键作用。无定形冷冻保护剂，如糖醇和糖类，在冷冻过程中通过优先排除冷冻保护剂和蛋白质的水合作用在热力学上保持稳定，如上图2 所示。

它们还通过玻璃化作用提供动力学稳定性，从而减缓蛋白质和脂质膜的聚集。一些冷冻保护剂，如葡聚糖，不能渗透化合物，但通过增加渗透梯度，也能够阻止内部结冰。

图3.水替代理论。

如上图3所示，冻干保护剂通过替换水和磷脂或蛋白质之间的氢键，在冷冻干燥循环的干燥阶段发挥作用。与冷冻保护剂一样，可以通过玻璃化实现动力学稳定，使脂质膜和蛋白质能够流动，从而达到结构和构象的稳定。

为了提高疫苗的稳定性，可以在制剂中加入其他赋形剂，例如缓冲剂、使表面引起的不稳定最小化的表面活性剂和不太常用的赋形剂，例如填充剂、有机共溶剂和张力调节剂。

案例研究—— 开发一种具有三种灭活血清型的耐热冻干脊髓灰质炎疫苗

通过使用实验设计(DoE) 方法，用多种赋形剂评估了脊髓灰质炎疫苗的不同配方，并检查了血清型的稳定性。

用有限量的赋形剂进行基本筛选没有显示出稳定的产品，因此进行了广泛的筛选，成功鉴定了稳定剂。

与液体制剂和其他市售脊髓灰质炎疫苗制剂相比，对最佳候选物进行优化产生了具有高热稳定性的最终制剂。

工艺开发

如下图4 所示，冷冻对产品特性有巨大影响，进而影响产品稳定性。缓慢冷冻会导致形成少量的大晶体，这可能对膜有害。快速冷冻减少了渗透水释放的时间，但是会产生更大的内部结冰风险。

图4.冻结率的影响。

快速或慢速冷冻之间的选择是困难的，但受疫苗敏感性和配方的影响。因此，在冻干循环开发过程中考虑冷冻速率对稳定性的影响至关重要。

产品温度在整个初级干燥步骤中至关重要，它会影响干燥时间、升华速率和稳定性。在优化疫苗的主要干燥参数时，值得考虑减少干燥时间与产品稳定性的成本效率。

在二次干燥期间去除水合壳会降低产品稳定性。残留水分增加还会导致坍塌、聚集和降解。因此，最佳残留水分含量和二次干燥条件也应该是开发阶段的一部分。

案例研究——初级干燥过程中产品温度对长期稳定性的重要性

在所检查的细菌疫苗的示例中，基于产品温度(Tp) 测试了三个不同的循环，并在稳定性方面检查了产品特性。通过比较冻干后活细菌疫苗的活细胞计数来量化稳定性。

冷冻干燥后立即保守（Tp 远低于崩溃温度（Tc ）但高于玻璃化转变温度（Tg ' ））和激进循环（Tp 高于Tc ）之间没有区别。

激进周期在几天和一个月后表现不佳，中间（Tp 在Tc ）和激进周期不如保守周期好，如下图5 所示。

图5.临界配方温度 (CFT)和冷冻干燥条件对疫苗稳定性的影响的相关性。

建议使用保守条件开始干燥周期，但对于某些疫苗制剂，高于Tc 的初步干燥可能不会导致稳定性损失。

概括

已经证明，冷冻干燥是提高疫苗热稳定性的理想技术。疫苗制剂开发应探索冻干保护剂和冷冻保护剂、其他稳定赋形剂的选择以及冻干过程中的冷冻干燥方案的影响，以防止对疫苗造成任何损害。

在开发项目中，应根据配方和工艺问题考虑对工艺条件的影响以及它如何影响产品质量属性，但通过了解这些潜在机制，可以实现合理开发以获得长期稳定性。

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