引言：

进实验室以后，一般第一个要学的就是WB这个大实验。虽然很基础，但是却必不可少。尽管在课堂上已经简单的学习过WB的原理，但是真的跟着学长学姐一步步学习起来的时候还是难免觉得笨拙，尤其是每一步要做什么，为什么要这么做，更是不甚了解。

因此我整理了WB的步骤、每一步的原理，希望大家看完本文能有所收获~

原理：

30% acrylamide mix：产生凝胶的基本物质

1.5M Tris(ph 8.8) ：使分离胶PH为8.8（与甘氨酸的pka接近，从而使不同分子量的蛋白产生不同的电泳速度，从而使不同分子量的蛋白分开）1.0MTris(ph 6.8)：使浓缩胶PH为6.8（可以通过甘氨酸和氯离子的作用产生压缩，从而使蛋白条带压细）

10% SDS阴离子去污剂：断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质二三级结构，消除蛋白质在迁移过程中结构的影响。与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物，由于SDS带有大量负电荷，蛋白质本身的电荷被掩盖，从而消除蛋白质迁移过程中自身电荷的差异造成的影响。同时能够助溶，蛋白质变为亲水，容易在水相中迁移。每克多肽可以与1.4g去污剂结合，当分子量在15kd-200kd之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，logMW（分子量）=K-bx（迁移率）

AP：提供acr丙烯酰胺和bis亚甲丙烯酰胺聚合的氧自由基，是acr和bis聚合的引发剂

TEMED：催化AP释放氧自由基，是反应的催化剂

（图1：配胶试剂）

1、清洗干净1.5mm或1mm玻璃板，检漏（有豁口和字的朝上）

2、倒掉水，配10ml 10%的分离胶（1.5mm板需要7ml，1mm板需要4.5ml）

（图2：不同浓度配胶方案）

10%方案如下：

3、混合后上下摇晃，注意不要放在手中配（否则温度太高凝固的快），静置15s后用1ml枪二档吸一档打（在一角加即可，不用来回加，否则容易出气泡。不过出气泡了也没事，加水压一下就浮上来了）

4、加进玻璃板中，随后均匀来回加水到满

5、等待20分钟

6、倒掉水，将架子倒置过来让水排干，用纸巾擦拭斜角（一定要擦干净所有的水！否则两层胶之间出现水层就废了），同时配浓缩胶4ml

7、加满分离胶后插入1.5mm或1mm的梳子，注意不要有气泡，等待20min

（图3：配好的胶）

（图4：A液体，B液，S液）

2、将96孔板摇15min

（图5：96孔板）

3、使用软件测定蛋白浓度

双击打开software→open/close→放入96孔板→open/close→protocols→protocal manager→protein Quant→DC protein Assay→plate 1→setting→read area→勾选加样区→read

4、使用计算机excel做直线回归，根据标准曲线计算需要加多少样品和buffer

标准曲线：如图输入数据，x为吸光度，y为浓度。勾选区域，图标→散点图。右键任意一个点，选择趋势线，勾选显示公示。然后根据公示计算样品的浓度。

样品加入量：100或50/浓度

原理：上样量50-100ug足够。如果蛋白浓度太高导致上样过小，可用裂解液稀释蛋白使总上样体积在10ul即可，勿用水稀释会改变PH值。上样不要过高，否则条带兜一大坨。

4xloading Buffer加入量：样品/3

原理： Loading buffer里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯氰FF起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液，加loading100℃加热，也是为了中止酶促反应，防止提取的蛋白质降解。

（图6：直线回归）

1、取出胶，按照豁口在内摆放（若只有一块胶，另一边则用塑料板装上，总之要封闭这个小槽）。放入盒中，注意对准电极（黑对黑，红对红），同时放在盒子有突起的那一边（到时候盖盖子才能盖上）。

如果同时要跑四块胶，那么就要用没有金属电极棍子伸出来的装胶盒放在无突起侧（反正你能把盖子盖上去就没错了，盖不上去就是放错位置了）。

2、加样混匀（先震荡后快速离心），PCR机器中100℃孵育5min

原理：通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。

（图7、8：蛋白样品）

（图9、10：100℃孵育5分钟）

3、将样品加入孔中，两端为8ul和4ul的marker

4、制备10xrunningbuffer：Tris base30.3g，Glycine 144.1g，SDS10g，ddH20到1L

制备1xrunningbuffer：900mlddH20+100ml 10xrunning buffer

5、跑胶100V30min（浓缩胶），130V 50min（分离胶），跑到底部。注意观察底部铁丝是否冒气泡，开始冒气泡则说明成功跑起来啦！

（图11：跑胶）

1、甲醇活化PVDF膜10min

原理：PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。大于20000的蛋白选用0.45um的膜，小于20000的蛋白选用0.2um的膜。PVDF膜在使用时需预处理，用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。

（图12：甲醇活化）

2、制备1xtransferbuffer（冰上保存）

10xtransferbuffer：tris 30.3g+Glycine144g+ddH20到1L

11xtransferbuffer：100ml10xtransferbuffer（一般都放在冷室里）+100ml甲醇（一般都在通风橱）+800mlddH20

3、关闭电源，取出胶，切去不用的区域，并在左上角做标记（目的是标记第一个条带的上方。分不清楚的话看marker颜色也行，第一条marker加的8ul，颜色浓。），同时立刻清洗玻璃板，留给下一个人一块干净的玻璃板。

（图13：切胶）

4、在玻璃盒中加入转膜buffer，做三明治（黑底在下）：海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵

注意：不要有气泡！不要将胶放干！

原理：电场力作用条件下，带电粒子（PAGE胶中的蛋白）会发生定向迁移

（图14：三明治）

5、将三明治夹起后放入电泳盒（黑对黑，白底朝上），倒满转膜buffer并放入2个冰盒，盖上盖子放到一个盒子里，外周也塞满冰，插电跑胶室温100V  60min或者4℃冷室内30V转膜过夜（过夜的话最好加入转子散热均匀）。

原理：转膜过程会产热导致蛋白质降解，因此要使用冰散热

（图15、16：转膜）

1、配5%牛奶：2.5g脱脂奶粉+50ml1xTBST

（图17：配牛奶）

2、在膜左上角（目的还是为了标记第一个条带，但是上下不要弄反了。加样出发的地方是上，蛋白跑到最后的地方是下。）做标记，放入牛奶中摇1h。

原理：PVDF膜上有许多孔洞尚未结合蛋白，若不封闭这些地方，一抗就会非特异性结合上去。因此需要用牛奶中的蛋白质结合这些孔洞。

（图18：封闭）

3、用塑料膜包裹，对着marker标记一下大小。根据样品蛋白的大小区域裁剪成条带，左上角剪角。加一抗，4℃过夜/室温2h摇晃。回收一抗，用1xTBST洗4次，每次10min。

原理：待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。

（图19：蛋白质大小）

4、倒尽TBST，加入二抗孵育摇晃2h，之后再用1xTBST洗4次，每次10min。

原理：用一抗处理过的PVDF膜再用标记的二抗处理，带有标记（HRP辣根过氧化物酶）的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。

（图20：孵育/洗膜）

5、将PVDF膜擦干净，放在曝光盒的膜中央，滴加显影液HRP（辣根过氧化物酶底物）浸润满，阖上膜，注意不要有气泡，盖上盒子

备注：有另一种ECL工作液，包括鲁米诺和过氧化物，二者避光保存，现配现用(1：1配制)，用时滴在膜上就行

原理：二抗中的辣根过氧化物酶催化过氧化氢，底物被氧化产生发光效应

（图21、22：显影）

6、到暗室里，锁上门，打开曝光盒，擦去多余的液体并放入胶片10s/30s/1min（时间根据胶片情况而定），放入机器中曝光。

注意：不用打开塑料膜！贴在塑料膜上即可！

（图23、24：曝光）

六、结果标记和保存

现在你获得了一张完美的WB胶片结果，但是为了方便日后查看，所以需要在胶片上标记：样品名称，一抗名称，marker条带和大小，你的名字，日期。

然后拿去电脑上扫描，保存一份电子版。