各类western转膜条件 |
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建议：海绵厚度要合适，一次转磨用的海绵太薄，导致三明治没夹紧，转膜后拿出来一看，marker都变得七扭八歪。但是有前辈说垫的海绵太厚可能将胶压断，没经历过，不知道是不是会有这种情况。 蛋白来源：肿瘤细胞 蛋白名称（可保密）：磷酸化蛋白 蛋白分子量：10-200 KDa WB用膜类型、孔径：millipore PVDF膜 0.45 um 转膜方式（恒压、恒流）：120 v 恒压 转膜时间：120 min 转膜设备：湿转 Bio-Rad 建议：转膜缓冲液只用2次，基本都转上，5%BSA封闭，减少背景。 蛋白来源：胰腺β细胞 蛋白名称（可保密）：****** 蛋白分子量：90-130 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：250 mA 恒流 转膜时间：150 min转膜设备：湿转 蛋白来源：原核表达 蛋白名称（可保密）：保密 蛋白分子量：38 KD WB用膜类型、孔径：0.45 NC 转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒压：100 V转膜时间：120 min 蛋白来源：心脏 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：220 kDa，130 kDa，70 kDa，41kDa WB用膜类型、孔径：PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：恒压 转膜时间：70 v120 min，180 min，5-6 h 转膜设备：伯乐湿转 建议改进方向（可选）：40 kDa一下，70 v ，60-90 min足够，40-70 kDa 90-120 min即可。70-120 kDa ，70 v，120-180 min足够，120-180 kDa ，180-240 min，180 kDa以上建议6 h。 蛋白来源：卵巢癌细胞膜蛋白 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：53 KD WB用膜类型、孔径：PVDF膜 0.45 um 转膜方式（恒压、恒流）：恒压 转膜时间：80 V 100 min转膜设备：湿转 Bio-Rad 蛋白来源：人宫颈癌HELA细胞总蛋白 蛋白名称（可保密）：β-actin 蛋白分子量：42 WB用膜类型、孔径：PVDF膜 0.45 um 转膜方式（恒压、恒流）：恒压 转膜时间：50 4 h 转膜设备：湿转 Bio-Rad 蛋白来源：脑组织 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：16 KD、27 KD、32 KD、42 KD WB用膜类型、孔径：PVDF 0.22 um 转膜方式（恒压、恒流）：半干转 恒流 1 mA/cm2或2 mA/cm2 转膜时间：不定 转膜设备：北京六一仪器 建议：我共做了六个蛋白，所以总在想节约时间的方式。在预试时我会观察电压数与转膜效率的关系，所以我不会按时间来定何时转完，而是按电压来定。通过染胶来确定电压数与转移蛋白分子量上限的关系。这样有的5分钟就转完了，不用多浪费时间。并且六一的半干转膜仪随着使用次数的增多，效率也会下降，所以时间和转膜效率（尤其是使用后期）的关系并不稳定，单纯依靠时间有时会有问题。 蛋白来源：CHO cell 蛋白名称（可保密）：酶原 蛋白分子量：40 KD WB用膜类型、孔径：0.22的PVDF膜（Biorad） 转膜方式（恒压）：100 V，湿转，转膜时间：60 min。 设备：Tanon（上海天能） 建议： 1. 转膜液现用现配，用完倒掉。2. 转膜时间，电压可以适当调整。分子量大或者小一些的蛋白，采用此条件一样转膜效率很高。 蛋白来源：Hepg2 蛋白名称（可保密）：EGFR 蛋白分子量：170kd WB用膜类型、孔径：pvdf 0.45 转膜方式（恒压、恒流）：24V 转膜时间：2个半小时 转膜设备：伯乐半干转 蛋白来源：肝癌细胞 蛋白名称：HIF-1α 蛋白分子量：120 kD WB用膜类型、孔径：NC膜 转膜方式（恒压）：80伏，湿转 转膜时间：150分钟 设备：“Bio-Rad mini”建议：湿转，转膜液特别重要，否则会导致电压或者电流不稳影响转膜条带。转膜均现配先用，不重复利用。转膜时间一般是150分钟，80伏恒压。经李春红染色，靠近蛋白胶的一侧膜上蛋白染色深，膜另外一面染色浅，说明蛋白未转过。该湿转条件自己做过的蛋白分子量范围：170-36 kD。 蛋白来源：心肌细胞总和膜 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：128 KD，100，60，55，43 KD WB用膜类型、孔径：NC膜 0.2 um 转膜方式（恒压、恒流）：恒压 转膜时间：70 V 200 min 转膜设备：湿转 Bio-Rad 建议：转膜液最好现配现现用，或配成母液，最好不重复使用，70 V电压下，电流约154 mA。甲醇可以加到150 ml。对大分子量如200 KD转膜时间延长6-8 h。 |
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