所以今天就来跟大家分享一下western那些你没有注意到的的小细节，细节决定条带！！！

Part 1：首先，western开始之前，先啥也别干，拿出你的抗体说明书，仔细阅读一下，拿出你的小本本，写下以下几条：

①    要跑的指标，并找到他们的抗体和说明书；

②    分子量的大小，这样你可以看配多浓的胶，而且你可以排一下，比如如果3个指标分别为28kd、60kd、130kd，完全可以一板胶解决！如果跑过了能叫准了每个指标的位置，我最多一板胶跑过五个指标😏，但一开始还是稳着点。

③    抗体稀释比例，如果告诉你稀释比例1：10000，求求你别找0.1ul的枪，可以配一个1：1000的再稀释。

④    抗缓是哪种，可以买现成的也可以自己配，说明书上一般会写，没写的话一般有2~5gBSA+100mlTBST,或者2~5g脱脂奶粉+100mlTBST（脱脂奶粉超市买的就行，我们实验室买的伊利的，便宜又耐用，一袋够我用到地老天荒，借别人一点也不心疼）。一般都是4℃过夜，也有室温1h的。我一般抗体没特殊要求都4℃过夜。

⑤    封闭液的选择及时间。一般用5%BSA（5gBSA+100mlTBST）或5%脱脂奶（5g脱脂奶粉+100mlTBST），基本上大部分都用脱脂奶粉，现在一般抗体说明书都建议封闭液用什么抗缓就用什么，一般说明书上好歹会写一样，都没写的话给技术支持打电话。放心大胆打电话，又不收钱，也不知道为什么好多人都不愿意打。

⑥    封闭时间：30min~2h。普遍来说，一般单一条带好出的半小时到一小时就够了，有的指标两个条带的我可能会封闭到两小时，背景过高或者杂带特别多的时候有时候也会4℃过夜封闭。

⑦    检查所需试剂都在哪，都够不够用。

Part 2：奉上我们实验室的小配方们，当然，如果你不在意这点小钱都买了现成的就可以直接跳转到part 3了。

Part 3：配胶（建议提前一天配）——如果你豪气的买了现成的胶请直接跳到part4

      这个大家就按自己的配胶试剂盒配就好了，有一些自己的小经验：

①    不要为了图快让胶凝的太快，室温一般二十分钟左右就能凝了（分离胶浓缩胶都是），夏天我怕凝的太快一般都会把试剂先用现从4度拿出来。

②    最后加TEMED，如果配胶时发现东西没准备好，可以先不加TEMED去准备，准备好再加TEMED，加完就开始凝啦！

③    混匀胶液时一定要记得不要晃太大力，一般配好多板胶的时候怕晃不匀可能会用注射器抽吸混匀，一定要轻柔，不要吹起太多气泡！气泡乃western头号大敌！

④    一般灌完胶烧杯底部还会剩一点点，我一般先不扔掉，放在旁边，一开始不太会看凝没凝的时候可以看看烧杯里有没有凝，要是烧杯里升的成半凝固状态，胶就凝的差不多了。

⑤    分离胶灌完封胶的时候用去离子水或者无水乙醇，之前有人说无水乙醇封胶效果更好，我认真的做了对比，没有太大的差别，无水乙醇封完还得拿水洗一下，所以就直接用去离子水封胶，待分离胶凝固后倒掉去离子水，用滤纸搭在玻璃板边缘吸干残留的去离子水，不要把滤纸伸进玻璃板，有时候滤纸掉渣，渣掉进去就不好了。

浓缩胶一般在1~2cm，灌完插梳子时要斜着插，不要垂直插！不要垂直插！斜着插气泡就跑出来了。like this：

①    配完第二天就用的话可以直接把胶放在一个塑封袋（实验室应该多的是，随便攒几个不同大小的就够用了）里放在4度。亲测100+遍不会干（起码能挺两三天）。如果不放心可以泡在水里放4度。

好了，western的准备工作就完成了，做完这些准备工作后是不是突然对western有信心了呢！那么我们今天就可以好好休息养精蓄锐，明天来一起精力充沛的做western吧