2

切胶回收产物

在紫外仪下切下目的产物，注意一定要快准狠，尽快切下，并尽可能少的切下多余的胶，回收利用的试剂盒一般严格按照试剂盒操作应该没有什么问题。回收之后测浓度，准备下一步。

3

连接

这一步骤就直接按照选择的T载体说明书来操作了，需要注意的是，在上一步测完回收浓度后，如果浓度较低，建议在试剂加量上尽量加大DNA的用量。

一般来说回收之后就赶紧地进行连接，但是由于有时候可能中间时间耽误了，没能及时连接，那么在这之前可以补加两个步骤，一是加A尾，二是纯化回收的产物。

但是在长期的尝试中，我发现纯化与否和手动加A尾并不怎么影响连接效果。

4

转化铺板

这个步骤用来筛选重组子，长出来的菌多不是好事，菌少也不是坏事，也许就只长两个单克隆菌，但这两个都是阳性重组子，反正只要挑到正确的就行。

5

菌液PCR鉴定

一般挑菌之后在EP管中摇个3到5个小时就可以进行菌液PCR了，一般来说这样的摇菌时间能最保证接近真实的阳性结果，菌液PCR之前有人建议说要煮沸几分钟再P,但其实直接取摇菌的1ul作为模板，进行PCR 就可以了，条件与之前P产物的条件一致。

6

酶切鉴定

酶切位点的选择必须要确保 目的基因中没有这个位点，而载体与目的基因连接附近有位点。在进行酶切的时候是要摸酶切时间的，是否已经切开跑一个电泳看看。

7

测序鉴定

如果实在是觉得上面两个鉴定都拿不准，那也可以尝试测序，如果测序结果与目的基因能够完全比对匹配上，那么也说明就是连接上了。

师兄：你看看，其实TA克隆是非常简单的克隆，先天的条件A和T都已经具备了，除非你手实在不顺，连个2500bp以下的都是没什么问题的。

我：好吧，师兄，我发现你说的注意的点我好像是有问题，我再来试试吧。

师兄：做实验嘛，也就是不断尝试了才能积累经验，说不定再做几次你就是克隆小公主了呢！哈哈！返回搜狐，查看更多