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在酶切连接克隆及TA克隆中,都会借助T4 DNA连接酶将插入片段连入载体中。你是否好奇T4 DNA连接酶的原理?T4 DNA连接酶在酶切连接克隆及TA克隆中又是如何将片段与载体连接起来的呢?今天的克隆小讲堂就为大家分享T4 DNA连接酶的原理和应用。 01什么是T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶属于DNA连接酶的一种。DNA连接酶在体内可以催化双链DNA中单链DNA断裂处生成磷酸二酯键。DNA连接酶在生物体内有重要的生物学功能。在DNA修复和重组中,DNA 连接酶起到将缺口连接的作用。在DNA复制过程中,后滞链的合成是不连续的,由DNA连接酶将不连续的DNA链连成连续的DNA链。 DNA连接酶根据辅因子的不同,可分为2类:ATP依赖的连接酶和NAD+依赖的连接酶。T4 DNA连接酶是首个被发现的ATP依赖的DNA连接酶。 在酶切连接实验中,制备线性化载体和插入片段时,会使用相同的限制性内切酶消化载体和片段,限制性内切酶能识别特异的双链DNA序列,以内切的方式水解核苷酸链中的磷酸二酯键,产生特异的DNA片段,片段5' 端为磷酸基团,3' 端为羟基。T4 DNA连接酶可以催化相邻的5' 磷酸基团的末端和3' 羟基的末端,生成磷酸二酯键。 02T4 DNA连接酶的作用原理 T4 DNA连接酶的作用过程可以分为3个步骤。 第一步:连接酶的赖氨酸活性位点对ATP的α-磷酸基团亲核攻击,释放PPi,并生成T4 DNA连接酶-AMP中间体。 第二步:DNA链的5' -磷酸基团攻击连接酶-AMP中间体,AMP被转移到DNA链的5' -磷酸基团上,生成DNA-腺苷酸中间体。 第三步:DNA链的3' -羟基进攻5' -磷酸基团,形成磷酸二酯键,释放AMP。 03T4 DNA连接酶在克隆实验中的应用 应用场景1 酶切连接——单酶切,粘性末端的连接 当使用单酶切的方法制备线性化载体和插入片段时,如果载体和插入片段的末端是粘性末端,因片段的粘性末端是相同的,插入片段无论正向还是反向,插入片段突出的末端都能与载体突出的末端配对,形成氢键,在T4 |
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