听力损失是最常见的感觉神经障碍之一，每1 000名新生儿中约有1~3名受到影响[1-2]。世界卫生组织最近调查表明，目前全世界有超过4.5亿人受到听力损失的影响，预计到2050年将达到25亿人[3]，防聋治聋已成为全球关注的公共卫生项目。

据研究报道，至少60%的早发性听力损失或听觉减退病例与遗传原因相关[4-5]。大多数遗传性听力损失是感音神经性听力损失(sensorineural hearing loss，SNHL)，并作为一种简单的孟德尔特征遗传。遗传性SNHL分为常染色体隐性遗传(80%)、常染色体显性遗传(15%~20%)、X连锁遗传(1%)或线粒体遗传(1%~5%)[6]。根据是否累及其他器官，耳聋可分为非综合征型和综合征型，可能为先天性，也可能是由环境因素引起的，如感染、创伤或耳毒性药物[7]。

SLC26A4基因突变是继GJB2突变之后第二常见的遗传性听力损失因素[8]。SLC26A4基因位于7q22-31染色体上，包含21个外显子，编码一种名为Pendrin的高度疏水膜蛋白[9-10]。Pendrin蛋白在几种组织中表达，包括甲状腺和肾脏，以及内耳的上皮细胞[11]。据报道，SLC26A4基因突变会导致Pendred综合征和非综合征性听力损失伴前庭导水管扩大[12-13]。EVA是一种常见的常染色体隐性听力损失，是与遗传性SNHL相关的最常见的内耳畸形[14]。

本研究发现一个由SLC26A4基因突变c.919-2A>G、c.1746del G以及c.563T>C复合杂合突变引起前庭导水管扩大的家系。该家系中，先证者携带SLC26A4基因3个复合杂合突变位点并表现为双耳极重度感音神经性聋。其父母为听力正常的单个或2个突变杂合携带者。本研究结果提示这3种致病性突变会引起听力下降，这将延长中国人群SLC26A4突变谱的知识范围，有利于我们探索突变中表型与基因型的关系。同时也能帮助临床医生诊断SLC26A4突变引起的遗传性聋。

本研究中耳聋家系由两代人3名家庭成员组成。医学伦理审查由本院医学伦理委员会批准，所有受检者均签署知情同意书。详细家系图如图 1所示。

采集家系成员的外周血各5 mL，EDTA抗凝，用血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司)提取样本DNA，具体步骤参照试剂盒说明书。用Nanodrop 2000超微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度，取适量样本稀释至浓度100~200 ng/μL，其余-20 ℃保存。

采用全外显子组液相捕获技术，使用Illumina HiSeq X10对人的全外显子区域DNA进行高效、特异富集，然后进行高通量、高深度测序。具体步骤为：基因组DNA→超声随机打断→未端修复，3，端加“A”→接头连接及纯化→Pre-PCR全基因组文库制备→探针杂交(16~24 h)→捕获磁珠与探针结合→洗涤文库复合物→Post-PCR扩增文库→文库定量及质检→上机测序。测序数据经软件匹配分析后，上传至在线软件系统进行变异过筛及解释。

PCR扩增目的片段：引物设计合成并确认DNA模板质量合格的情况下，可以安排进行PCR扩增，反应体系一般为25 μL。5%琼脂糖凝胶电泳：取适量PCR未纯化样品，加入Loading Buffer，混匀后加至1.5%琼脂糖纯化胶的孔中，于120 V电泳约30 min结束。DNA凝胶回收：①电泳结束后，于紫外灯下参照DNA Marker根据片段大小割取相应条带放入2 mL离心管中。②向离心管中加入400 μL Buffer DE-A，混匀后于75 ℃水浴加热直至凝胶块完全熔化。③向离心管中加入200 μL Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小于400 bp时，需加入150 μL异丙醇，颠倒混匀。④将混合液全部转移至吸附柱上静置5 min，3 600 r/min离心1 min，弃废液。⑤将吸附柱置回2 mL离心管，加500 μL Buffer W1，静置3 min后3 600 r/min离心1 min，弃废液。⑥将吸附柱置回2 mL离心管，加700 μL Buffer W2，静置3 min后3 600 r/min离心1 min，弃废液。重复该步骤一次。⑦空管离心12 000 r/min，离心2 min，弃废液。⑧转移吸附柱至新的1.5 mL离心管中，空气自然干燥8~10 min。⑨加30 μL ddH2O(70 ℃预热)至吸附柱滤膜中央，静置5 min，12 000 r/min离心1 min。丢弃吸附柱。⑩取2 μL回收后的DNA与1 μL Loading Buffer混匀后加至1%琼脂糖凝胶电泳5 min左右，于紫外灯下观察是否有条带及条带亮度。测序：①测序PCR反应；②测序PCR产物的纯化；③甲酰胺变性；④上样测序。

以千人基因数据库中v37版本作为参考基因组，将有效测序数据进行bwa比对，找到单一比对到基因组上数据序列，将其与外显子组区域再比对，随后进行目标区域中单碱基深度分布和覆盖度均一性分析。利用Genome Analysis Toolkit软件对read的碱基质量进行重新校正，使其更接近真实。突变数据库来源包括1000 Genomes和dbSNP等。进一步比对ClinVar临床数据库，OMIM(人类孟德尔遗传)数据库，HGMD(人类基因突变)数据库及自建数据库和中英文杂志发表的研究论文进行变异的致病性分析。

此家系共两代3人，遗传方式为常染色体隐性遗传，家系图见图 1。患者为20岁女性，2岁时因听力下降就诊，并植入左侧电子耳蜗，进行言语训练。前庭导水管扩大的诊断主要依靠颞骨CT检查，患者颞骨CT检查结果见图 2，根据CT结果确诊先证者为前庭导水管扩大患者。患者父母无相关家族病史，且听力均正常。

对患者进行全外显子检测结果分析后，发现患者携带SLC26A4的3个致病位点(c.919-2A>G、c.1746delG、c.563T>C)。为了进一步验证上述突变的来源和致病性，对患者及其父母进行了上述位点的一代测序验证(图 3)，结果显示，先证者听力正常的父亲携带SLC26A4基因的c.919-2A>G杂合突变，而先证者听力正常的母亲携带SLC26A4基因的c.1746delG和c.563T>C杂合突变(图 4、5)。见表 1、2。

突变位点1：检测结果显示受检者的SLC26A4基因发生杂合剪切突变(c.919-2A>G)，从而影响到了该基因编码的蛋白质的功能。与疾病相关的人类基因组变异数据库和人类基因突变数据库均认为该突变为致病突变。致病性判读：根据美国医学遗传学与基因组学学会的《遗传变异分类标准与指南》，该变异符合“致病”：PVS1+PM3+PM2-Supporting。

突变位点2：检测结果显示受检者的SLC26A4基因发生杂合移码突变，即编码区第1 746核苷酸发生缺失(c.1746delG)，使SLC26A4基因编码的蛋白第584位由丙氨酸变为精氨酸，且蛋白在第585位氨基酸发生提前终止，由此产生截短蛋白(p.Ala584Argfs*2)，而正常蛋白应由780位氨基酸组成。与疾病相关的人类基因组变异数据库和人类基因突变数据库均认为该突变为致病突变。致病性判读：根据美国医学遗传学与基因组学学会的《遗传变异分类标准与指南》，该变异符合“致病”：PVS1+PM3+PM2-Supporting。

突变位点3：检测结果显示受检者的SLC26A4基因发生杂合错义突变，即编码区第563号核苷酸由T变为C(c.563T>C)，由此导致SLC26A4基因编码蛋白第188位氨基酸由异亮氨酸变为苏氨酸(p.Ile188Thr)。与疾病相关的人类基因组变异数据库和人类基因突变数据库均认为该突变为致病突变。致病性判读：根据美国医学遗传学与基因组学学会的《遗传变异分类标准与指南》，该变异符合“致病”：PM3_VeryStrong+PM2-Supporting+PP3。

PolyPhen-2、Mutation Taster、FATHMM等数据库均预测c.1746delG和c.563T>C突变位点为致病性。

综上所述，受检者携带SLC26A4基因的3个突变(c.919-2A>G、p.Ala584Argfs*2、p.Ile188Thr)，均是明确与听力损伤相关的隐性疾病突变位点。因此，推测SLC26A4基因的上述3个突变以某种复合杂合的形式导致受检者患病。

每种氨基酸都有其特定的大小、电荷和疏水性。原始野生型残基和突变型残基在这些性质上往往有所不同。见图 6。

SLC26A4 p.Ala584Argfs*2：氨基酸在584号位置处由丙氨酸突变成精氨酸。突变型残基比野生型残基大，野生型残基电荷为中性，突变型残基电荷为正电荷，这可能导致配体或其他残基具有相同电荷的排斥，野生型残基比突变型残基更疏水。突变引入了一种具有不同性质的氨基酸，可以干扰该结构域并导致其功能受损。

SLC26A4 p.Ile188Thr：氨基酸在188号位置处由异亮氨酸突变为苏氨酸。野生型和突变型氨基酸大小不同，突变型残基比野生型残基小，这种突变会在蛋白质的核心部分造成一个空白区域。野生型和突变型残基的疏水性不同。突变将导致蛋白质核心疏水相互作用的丧失。突变的残基位于对蛋白质活性很重要的结构域上，并与另一个对蛋白质活性也很重要的结构域接触。这些结构域之间的相互作用可能会被突变所干扰，从而影响蛋白质的功能。

前庭导水管扩大是最常见的内耳畸形，累及多达15%的SNHL患者[15]。有证据表明，前庭导水管扩大是一种先天性遗传性疾病，主要表现为幼儿波动性感音神经性耳聋和眩晕，以及前庭导水管扩大。前庭导水管扩大的发生或加重与外伤、感冒有关[16]。

引起前庭导水管扩大的SLC26A4变异类型包括错义/无义单核苷酸变异，剪接变异，插入或缺失，产生终止密码子[17]等。迄今为止，已经鉴定出超过539个SLC26A4基因突变[18]。等位基因特异性变异率存在人群特异性差异。在北欧人群中，p.Leu236Pro、p.Thr416Pro、c.1001+1G>A和p.Glu384Gly在Pendred综合征和非综合征性前庭导水管扩大患者中比其他致病变异更常见[19-20]。在中国、日本、韩国和巴基斯坦人群中，c.919-2A>G、p.His723Arg和p.Val239Asp是常见的致病变异[21-23]。

在本研究中，在先证者SLC26A4基因中发现了c.919-2A>G、c.1746del G以及c.563T>C突变。据文献报道，这3个突变之前已被鉴定[24]，然而，这些氨基酸区域的序列保守分析和蛋白质结构分析远未明确。在结构上，序列同源性分析表明，SLC26A4的p.Ala584Argfs*2和p.Ile188Thr的氨基酸位点在不同物种中高度保守，这表明它们可能对Pendrin蛋白的结构和功能至关重要。而生物信息学分析结果表明，SLC26A4基因发生杂合剪切突变(c.919-2A>G)，从而影响到了该基因编码的蛋白质的功能。c.1746del G使SLC26A4基因编码的蛋白第584位由丙氨酸变为精氨酸，且蛋白在第585位氨基酸发生提前终止，由此产生截短蛋白(p.Ala584Argfs*2)，这可能导致Pendrin功能障碍。c.563T>C使编码区第563号核苷酸由T变为C(c.563T>C)，由此导致SLC26A4基因编码蛋白第188位氨基酸由异亮氨酸变为苏氨酸(p.Ile188Thr)，这可能导致Pendrin蛋白结构发生变化。由此可见，以上3个突变位点均会对SLC26A4基因编码的蛋白产生影响，进而影响人的听力。

有研究认为，前庭导水管扩大的表型与人群中SLC26A4突变等位基因的数量有很强的相关性[25]。Wang等[26]调查了95个前庭导水管扩大相关中国家系，数据表明，88.4%的患者携带双等位基因变异，单等位基因突变占9.5%，而另外2.1%没有SLC26A4等位基因突变。双等位基因突变可导致更严重的耳聋、发病年龄更早和前庭导水管更为扩大[27]。本研究中的患者发病年龄为2岁，表现为双耳极重度感音性聋，与以上研究一致。然而，SLC26A4基因的c.919-2A>G、c.1746del G以及c.563T>C突变在同一例患者中同时出现极为罕见。该复合杂合突变与表型之间的分子机制需要进一步的功能研究来阐明。

综上所述，我们在一个中国前庭导水管扩大家系的SLC26A4中发现了3个杂合突变位点(c.919-2A>G、c.1746del G以及c.563T>C)。同时携带上述3种突变极为罕见，此前未见相关中文报道，故对临床有一定的借鉴意义并进一步扩大了中国人群与前庭导水管扩大相关的SLC26A4突变谱。