使用说明： 1.One-Step qRT-PCR反应体系的设置： a.融解并混匀One-Step qRT-PCR反应所需的各种溶液，置于冰浴上或冰盒内。 b.参考下表在室温或冰浴上设置One-Step qRT-PCR反应体系(以96孔板，每孔反应体系为20μl为例)：

注意： (1)当检测样品比较多时，可根据样品数量先配制所需的相同试剂的混合液，一般多配制5-10%，然后再分装到每个反应孔中，最后再在每个反应孔中加入不同的试剂，这样可使所取的试剂体积更准确更均一，误差更小，并减少试剂损失。例如：检测的目的RNA相同，而RNA样品不同，则可以把除RNA样品外的所有试剂根据样品数量配制在一起，然后分液至每个反应孔中，最后再加入不同的模板RNA。 (2)通常引物的终浓度为0.2-0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况在0.1-1.0μM范围内调整引物的终浓度。 (3)通常RNA模板的量以1pg-2µg为参考用量，一般总RNA为100ng-1µg。因不同物种的模板中含有RNA的拷贝数不同，如有必要，可对模板RNA进行梯度稀释，以确定最佳的模板RNA使用量。同时，由于qPCR灵敏度极高, 建立反应体系时加入RNA模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响，因此建议将模板RNA适当稀释后加入反应体系中，比如每个20μl反应体系2-5µl，这样可以有效提高实验的重复性。 (4)不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器在配制反应体系时选择高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不加ROX。 (5)96孔板的推荐反应体系为20µl，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系。 (6)建议设置不加模板RNA的阴性对照组。 c.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。 d.将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。 2.One-Step qRT-PCR反应程序： 50℃ 15分钟一般可以得到理想的反转录效果，但如果片段较长，也可以增加至30分钟。在Real-time PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃ 2分钟，复杂或高GC模板适当延长时间至5分钟。本产品中的BeyoFast™ Taq DNA Polymerase可以在15秒内可完成至少300bp的扩增，可以满足绝大多数的qPCR实验；对于超过350bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。建议采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT荧光定量PCR仪为例： a.反转录：50℃ 15-30min b.预变性：95℃ 2min c.变性：95℃ 15sec d.退火/延伸：60℃ 15-30sec e.重复步骤c和步骤d，总共40个循环 f.熔解曲线分析(可选)：95℃ 15sec, 60℃ 15sec, 95℃ 15sec g.使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果 三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30sec，随后重复步骤c、d及增加的这一步骤共40个循环即可。 注：以上举例为常规qPCR反应系统，仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据模板、引物、目的片段的特点设定最佳反应条件，并根据比例放大或缩小反应体系。

常见问题： 1.荧光定量PCR结果不理想，出现特异性不好或扩增效率不高时，可能是由于以下原因造成： a.样品RNA发生降解。此时可以通过RNA电泳等方法确认所使用的RNA样品是否发生明显的降解，在反转录实验前的实验操作过程中需要严格注意无RNA酶的实验操作。 b.引物设计不佳。请选择适当的引物设计软件进行引物设计，注意引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。也可以尝试使用有文献报道使用过的引物，或者从碧云天订购经过测试的qPCR引物。 c.待扩增片段GC含量偏高。GC含量较高的情况下PCR会变得相对比较困难，此时宜更换引物。 d.PCR反应体系在室温设置时容易导致非特异性条带，但在使用热启动酶时可以有效避免室温操作导致的非特异性条带的产生。但对于一些较难扩增的产物，可以尝试在冰浴上设置PCR反应体系，以进一步减少非特异性的DNA扩增。 e.退火温度不佳，需要优化。这种情况下宜更换引物。 f.待扩增片段GC含量较高或长度较长，变性不够充分。此时宜更换引物，使待扩增片段的GC含量和长度适中。 g.模板量太低，此时宜适当加大模板量。 h.模板中含有抑制PCR反应的物质，可以用适当的DNA纯化方法例如柱纯化等纯化模板DNA。 2.反应条件优化方法： a.引物浓度：通常引物终浓度为0.2μM时可获得良好检测效果，终浓度可以在0.1-1.0μM范围内适当调整。如果希望提高反应特异性，可降低引物浓度；如果希望提高扩增效率，可增加引物的浓度，从而优化反应体系。 b.退火温度：建议采用两步法PCR，退火温度60℃进行反应。如果希望提高反应特异性，可提高退火温度，以60-64℃作为退火温度的调整范围。在引物Tm值较低而得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，三步法的退火温度请以56-64℃作为温度设置的参考范围。 c.延伸时间：建议采用两步法PCR，延伸15-30秒。对于超过350bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。 相关产品：