Q1：原核生物RNA能用我们的逆转录试剂吗？

A1：可以。原核生物RNA没有polyA尾，所以在逆转录反应体系中需要以Random primer作为逆转录引物。

Q2：延长逆转录时间，是否可以提高逆转录效率？

A2：对于大多数基因，延长逆转录时间对逆转录效率并没有显著提升；对于一些GC含量较高或含高级结构的模板，延长逆转录时间可提升逆转录效率。

Q3：如何评判RNA质量？

A3：RNA质量从两个方面反应：

(1) RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带，分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行逆转录反应，并适量加大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则 RNA 已完全降解，需要重新提取。

(2) RNA的纯度。RNA的纯度可以通过OD260/280和OD260/230两个比值是否在1.8-2.1范围内进行判断，蛋白、离子等残留会使比值降低。

Q4：如何选择逆转录的引物？

A4：根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT或基因特异性引物进行逆转录。

(1) 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。

(2) Oligo dT：适用于具有PolyA尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾）。 由于Oligo dT结合在PolyA尾上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

(3) 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因逆转录。

cDNA后续进行PCR扩增长片段，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物，因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短，可能会对长片段扩增造成稀释，后续扩增不出全长的目的基因；cDNA后续进行qPCR，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3’端和5’端的扩增偏好性。

Q5：可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗？

A5：不可以，逆转录产物cDNA是混合物，除了cDNA产物以外，还有buffer、逆转录酶、引物，同时还包含未转录的模板RNA，总RNA中的tRNA、rRNA等，都会干扰浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量。