PrimeScript™ RT

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PrimeScript™ RT-PCR Kit 品牌 Code No. 产品名称包装量价格（元）说明书数量 Takara RR014A PrimeScript™ RT-PCR Kit 50 Rxns ￥1,261

Takara RR014B (A × 4) PrimeScript™ RT-PCR Kit 50 Rxns × 4 ￥4,546

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■ 制品内容 (Code No. RR014A ; 50 次量*1) PrimeScript RTase (for 2 Step) 25 μl 5 × PrimeScript Buffer 200 μl RNase Inhibitor (40 U/μl) 25 μl dNTP Mixture (10 mM each) 150 μl Oligo dT Primer (2.5 μM) 50 μl Random 6 mers (20 μM) 50 μl TaKaRa Ex Taq HS (5 U/μl) 25 μl 10 × PCR BufferⅡ 250 μl Control F-1 Primer*2 (20 μM) 10 μl Control R-1 Primer*3 (20 μM) 10 μl Positive Control RNA (2 × 105 copies/μl) 20 μl RNase Free dH2O 1 ml *1 反转录反应20 μl 、PCR反应50 μl体系时可使用50次。 *2 Positive Control RNA用上游引物。 *3 Positive Control RNA用下游引物。 ■ 制品说明 PCR (Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应) 是一种使用两条引物在目的DNA序列两侧扩增特异性DNA片段的过程。它是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法，但RNA不能直接被扩增。经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。目前，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。 PrimeScript RT-PCR Kit是具有良好的延伸性能与高扩增效率的2 Step RT-PCR试剂盒。反转录反应使用了Takara Bio Inc.特别开发的M-MLV由来的新型反转录酶PrimeScript RTase；PCR反应使用了扩增性能良好的Hot Start 型DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS。本试剂盒具有以下优点： 1. 进行高效的RT-PCR扩增。 2. 在标准的RNA反转录反应温度 (42℃) 下，便可使具有复杂结构的RNA进行良好的延伸，可以避免RNA在高温条件下的降解。 3. 能有效抑制非特异性的PCR扩增。本试剂盒含有反转录反应及PCR扩增反应所需的全部试剂。 ■ 各种引物的序列引物名称各引物序列 Random 6 mers pd (N)6 Oligo dT Primer Takara Bio特别设计的dT区域* Control F-1 Primer 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ Control R-1 Primer 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ * 该序列和TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 (Code No. : RR019A/B) 的Oligo dT Adaptor Primer不同，不含有与M13 Primer M4匹配的序列。 ■ Positive Control RNA 本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒 (质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kb的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因) 为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。 PrimeScript™ RT-PCR Kit

图1. Positive Control RNA：使用Control Primer可以扩增462 bp的DNA片段 ■ 保存 -20℃。 ■ RNA PCR 的原理 PrimeScript RT-PCR Kit首先用PrimeScript RTase将RNA合成cDNA，再取一部分1st strand cDNA作为模板，由TaKaRa Ex Taq HS进行PCR扩增。将RNA反转录成cDNA的引物可以使用Random 6 mers、Oligo dT Primer或特异性下游引物。 PrimeScript™ RT-PCR Kit

图2. PrimeScript RT-PCR Kit原理图 PrimeScript™ RT-PCR Kit

图3. PrimeScript RT-PCR Kit 的操作流程 ■ 特点 RNA模板适用于所有RNA 扩增片段大小～12 kb 反转录酶 PrimeScript RTase (反转录反应最适温度42℃) DNA Polymerase TaKaRa Ex Taq HS RNase Inhibitor Kit中含有合成第一条cDNA链的引物 Random 6 mers、Oligo dT Primer和特异性下游引物 ■ 反转录反应时Primer的选择反转录引物的选择，应结合实验的具体情况，选择以下三种引物，即：Random 6 mers、Oligo dT Primer或特异性下游引物。对没有发夹结构的短链mRNA，上述三种引物都可以使用；一般情况下的反转录引物的选择请参照以下说明。 Random 6 mers 适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。 Oligo dT Primer 适用于具有PolyA Tail的RNA。(注意：原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类的真核生物的mRNA等不具有PolyA Tail)。特异性下游引物 (PCR时的下游引物) 必须与模板序列互补，需了解Target序列。 ■ 使用注意 1. 当同时需要进行数次RT-PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。 2. 用PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、TaKaRa Ex Taq HS等酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。 3. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放入-20℃保存。 4. 为了防止Positive Control RNA分解，应尽量避免反复冻融。有条件的实验室最好保存于-70℃～-80℃。 5. 分装试剂时务必使用新的枪头，以防止样品间污染。

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