图 1：cfMethyl-Seq 检测流程图

主要实验结果

01 高成本效益 cfDNA 甲基化组测序（cfMethyl-Seq）方法

为了能够克服传统亚硫酸氢盐测序（RRBS）只对完整基因组 DNA 上的 CpG 岛甲基化富集区域的局限，研究者开发了 cfMethyl-Seq 技术，仅需对富含 CpG 的区域进行甲基化分析，实现以更低的成本对 cfDNA 全基因组甲基化的测序（流程图见图 1 所示），研究者发现，基于 cfDNA 构建的 cfMethyl-Seq 文库显示特征条带的长度分别为 68bp，135bp 和 203bp。通过将 cfMethyl-Seq 文库和 cfDNA 全基因组测序（WGBS）文库以及在实体组织上的传统 RRBS 文库进行了比较，发现来自 CpG 岛、shore 和 shelf 区域的 cfMethyl-Seq 读数分别为 34.11%、12.38% 和 13.14%，而传统 RRBS 读数分别为 33.65%、13.35% 和 14.04%。其中在 CpG 岛的 cfMethyl-Seq 的富集程度是 WGBS（2.66%）的 12.8 倍。在同一实体组织的传统 RRBS 文库比较表明 cfMethyl-Seq 依旧获得相似的甲基化水平，且剪切的 cfDNA 与完整基因组 DNA 上的甲基化水平的呈显著相关。

图 2：研究设计和计算方法概述

02 模型对于肿瘤诊断的性能评估

研究者团队首先通过 RRBS 数据分析确定了实体瘤和邻近正常组织之间存在显著差异的癌症特异性标记物，经过 10 次运算平均获得了 23，748 个癌症特异性高甲基化标记和 28，197 个癌症特异性低甲基化标记用于癌症检测。然后利用患者 cfDNA 样本的 cfMethyl-Seq 数据，根据甲基化模式对四种肿瘤/特定组织甲基特征的读数进行去卷积化从而开发出两个叠加的集成模型，用于检测和肿瘤溯源。

利用来自 191 名非癌症患者和 217 名癌症患者（包括 49 名肠癌、30 名肝癌、106 名肺癌和 32 名胃癌患者）数据，然后从 217 名癌症 cfDNA 样本中，随机选择 75% 作为训练数据，25% 作为测试数据；从 191 名非癌症 cfDNA 样本中随机选择了 25% 作为测试数据，在剩余的 75% 中，随机保留了 30 个仅用于标志物发现的非癌 cfDNA 样本，并将剩余的非癌 cfDNA 样本用作训练数据，进行泛肿瘤的诊断效能评估。结果发现：所有单个标志物类型在癌症检测中的曲线下面积（AUROC）>0.9，从高到低依次为癌症特异性高甲基化标志物 AUC：0.966、组织高甲基化标志物 AUC：0.957、癌症特异性低甲基化标志物 AUC：0.944、组织低甲基化标志物 AUC：0.939。随即整合 4 种标记物获得的集成模型，其 AUC：0.974，在 97.9% 的特异度（即误诊一例）下，灵敏度为 80.7%，同时在早期癌症（I 或 II 期）样本，模型的 AUC：0.964，灵敏度为 74.5%。当将这些结果分解为不同癌症类型和分期时，灵敏度均达到或超过 63%（见图 3 所示）。

图 3：用于癌症检测的集成模型的诊断性能

03 模型对于肿瘤溯源预测能力评估

研究者又通过相同的验证策略评估癌症样本中模型的肿瘤溯源的预测性能。结果发现：在 4 个肿瘤类型中，癌症特异性高甲基化标志物的平均准确率为 80.0%，癌症特异性低甲基化标志物为 83.6%，组织特异性高甲化标志物为 79.4%，组织特异性低甲基化标志物为 80.0%。且低甲基化标志物相比高甲基化标志物预测准确性更优。通过整合四种标志物类型，肿瘤溯源预测集成模型在所有分期的平均准确率为 89.1%，在早期癌症患者，模型平均准确率为 85.0%。对于具体不同肿瘤类型的预测分析中，模型对于结肠癌、肝癌、肺癌和胃癌的预测准确率分别为 86.7%、89.7%、90.0%、83.3%，在早期模型预测准确率分别为 80.0%、81.2%、93.0% 和 81.8%（图 4 所示）。

图 4：用于肿瘤溯源预测的集成模型的性能评估

总结

该研究开发了一个集成的实验和计算系统，用于解决当前基于 cfDNA 的早期癌症检测的主要挑战：即血液中的低肿瘤负荷，肿瘤的分子异质性，以及训练样本量太小而不能准确地代表疾病和患者群体的异质性等局限。cfMethyl-Seq 能够 以经济高效地分析 cfDNA 的全基因组甲基化特征，在四种常见类型肿瘤患者的血液分析中，展现了其检测肿瘤和肿瘤溯源具有较高的准确性，特别是对于早期患者的诊断同样有优异表现，且集成模型的诊断稳健性不依赖于其他混杂因素的干扰，再次验证了基于 cfDNA 甲基化特征作为肿瘤早期检测具有重要价值。

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