DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰形式，它涉及到DNA分子上的甲基基团的添加。DNA甲基化可以发生在胞嘧啶的C-5位、腺嘌呤的N-6位、鸟嘌呤的N-7位等，它们分别由不同的DNA甲基化酶催化，生成5-甲基胞嘧啶（5-mC）、N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。

一般研究中所涉及的DNA甲基化主要是指发生在CpG位点（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点）中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，其产物称为5-甲基胞嘧啶（5-mC）。5-mC广泛存在于植物、动物等真核生物基因组中，是目前研究最多的一种DNA甲基化修饰形式。

DNA甲基化在生物体内起着重要的调控作用。它可以影响基因表达、细胞分化、胚胎发育、染色体稳定性以及抗逆性等生物过程。甲基化模式的改变与多种疾病的发生和发展密切相关，如癌症、心血管疾病和神经系统疾病等。

DNA甲基化对生命过程的影响

目前已报道了多种DNA甲基化研究技术和方法。MassARRAY是基于质谱分析原理，可以高效、准确地检测DNA甲基化水平。MassARRAY技术可以对多个CpG位点进行定量分析，从而揭示DNA甲基化在基因组范围内的分布和变化情况。

MassArray 技术方法检测甲基化，其原理是利用亚硫酸氢钠在碱性条件和氢醌的催化下处理DNA，使非甲基化的胞嘧啶发生脱氨基反应从而转变成尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶不能发生脱氨基反应，仍保留为胞嘧啶。第一轮扩增时，转化后的U 与A 配对，在第二轮扩增中进一步转变为T。最终使甲基化C 与非甲基化C 的区别，变成了C 与T 的区别。

经过CT处理DNA样本后，PCR 扩增后把产物进行SAP (虾碱性磷酸酶) 消化，然后用T7 RNA & DNA Polymerase 和RNaseA酶对产物同步进行逆转录和酶切，得到含有CpG site的小片段，而甲基化和非甲基化的片段分子量是不同的（根据碱基G和碱基A之间16 Da的分子量差异区分出甲基化和未甲基化的C），通过时间飞行质谱即可区分片段并计算甲基化比例。飞行质谱能测出每个片段的分子量，配套软件 EpiTYPER 则能自动报告每个相应片段的甲基化程度。

实验技术流程图

DNA甲基化数据报告示意图

中通量：适用1-20个片段的中通量验证，样本数量不受限

长片段：覆盖约400-600bp长度的区域位点，属于最长的locus-specific assays

高准确：扩增子内单个CpG sites进行准确定量

高灵敏度：可检测低至5%的甲基化水平，特异性良好

数据简便：可视化数据产出

期刊：EBioMedicine

影响因子：11.1

肠屏障损伤在克罗恩病（CD）的发病机制中起着重要作用，而密蛋白（CLDNs）功能障碍导致肠粘膜损伤。SOX9 是一种重要的转录因子，在 CD 患者受疾病影响的结肠中表达上调；然而，它在 CD 中的确切作用仍然很大程度上未知。研究的目的是探索 SOX9 和 CLDNs 之间的相互作用，并进一步阐明 CD 的潜在机制。

使用RT-PCR、免疫印迹和免疫组化检测 SOX9 在CD 患者组织中的表达。通过双荧光素酶报告实验、染色质免疫沉淀（ChIP-QPCR）、过表达和 RNA 干扰方法分析 SOX9 和 CLDN s之间的调控关系。通过生物信息学分析预测参与SOX9-CLDN通路的MicroRNAs（miRNAs），并通过MassARRAY甲基化检测进一步解释上游分子机制。

在 CD 患者和接受三硝基苯磺酸 (TNBS) 刺激的小鼠中，受疾病影响的肠粘膜中 SOX9 的表达上调。SOX9 负向调孔 CLDN8 的表达，并伴随有肠道通透性降低。由于异常的 miR-145 启动子高甲基化，在 CD 和 TNBS 诱导的结肠炎小鼠中发现 miR-145-5p 下调，随后干扰了 SOX9-CLDN8 通路。MiR-145-5p agomir 治疗通过抑制 Sox9 表达并恢复 Cldn8 表达来减轻野生型小鼠中 TNBS 诱导的结肠炎，而在 Cldn8 −/−小鼠中类似的发现并不明显。

miR-145 启动子的高甲基化抑制 miR-145-5p 表达

分子机制：

SOX9介导上游miR-145-5p和下游CLDN8之间的串扰，并进一步损害CD中的肠粘膜屏障稳态。靶向 miR-145-5p/SOX9/CLDN8 通路代表了一种有前途的 CD 治疗策略。

 miR-145-5p/SOX9/CLDN8 通路模型

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