【摘要】

自1993年发现骆驼重链抗体（VHHs/单域抗体/纳米抗体）以来，其作为研究、诊断和治疗工具一直备受关注。1996年至2001年期间，比利时和荷兰的开创性研究小组获得了多项商业专利。Ablynx成立于2001年，旨在探索纳米抗体药物的治疗应用和开发。Ablynx经过二十多年的广泛努力开发出成了首个获得EMA和FDA批准的纳米抗体药物caplacizumab (Cablivi)（2018-2019年），用于治疗患有获得性血栓性血小板减少性紫癜 (TPP) 的成人罕见的凝血障碍。从骆驼单域抗体发现到进入市场的相对较长的开发时间反映了该方法的新颖性，以及知识产权限制和运营自由问题。第一个单域抗体药物的获批以及关键专利的到期，可能为骆驼单域抗体作为未来几年的主流生物治疗药物开辟新的前景。纳米抗体的药物是否会比传统抗体便宜还有待观察。在这篇综述中，作者提供了关于骆驼单域抗体的重要观点，并介绍了它们作为诊断和治疗药物被广泛采用的前景和挑战。

【前言】

基于IgG的单克隆抗体（mAbs）在过去几十年已广泛用于医学研究，截至2021年12月有100种IgG mAbs药物被批准。IgG分子由两条相同的重链（包含VH、CH1、CH2和CH3四个结构域）和两条相同的轻链（包含VL和CL两个结构域）组成四聚体结构。抗体可变区(VH和VL)内的短片段表现出高度的可变性，它们直接参与抗原结合，被称为高变区/环或互补决定区(CDR)（图1）。

这些结构域采用保守的Ig折叠结构，由两层反平行的β折叠组成，与疏水氨基酸侧链紧密堆积，形成β桶状或三明治状结构。IgG的C末端区域（也被称为可结晶片段或Fc）包含CH2和CH3结构域，非常保守并具有各种效应功能。抗原结合片段（Fab）包含两个可变区（VH和VL）和两个恒定区（CH1和CL）。Fab与Fc之间还有一个铰链区（各类型IgG之间的长度不同），该区对于使Fab旋转158°以及Fab-Fab、Fab-Fc分别获得115-172°、66-123°的角度方面起着至关重要的作用。

图1 骆驼IgG和美洲驼血清IgG对蛋白A和蛋白G分离的示意图（a）。每种IgG同种型的比较结构已显示在泳道2、4和6的顶部（b）。用蛋白G和A分离美洲驼免疫球蛋白血清，并在还原和非还原SDS-PAGE上运行。泳道1：MW Marker；泳道2：IgG2（蛋白A）（非还原型：NR）；泳道3：IgG2（还原：R）；泳道4：IgG1（蛋白A&G）（NR）；泳道5：IgG1 （R）；泳道6：IgG3（蛋白A&G）（NR）；泳道7：IgG3（R）（c）。右侧显示了具有五条和四条β-链的两个β-折叠的VHH 折叠结构，其中CDR 环以深绿色 （CDR1）、红色 （CDR2）和蓝色（CDR3）显示。

经过对几种哺乳动物物种Ig变体的结构、遗传学和功能结合进行几十年深入分析，抗体的传统概念发生了巨大变化。20世纪90年代，布鲁塞尔自由大学Raymond Hamers教授领导的研究小组从摩洛哥健康单峰骆驼的血清中发现缺乏轻链的较小IgG亚类。1993年发表的第一组数据显示，单峰骆驼的血清除了常规的IgG（IgG1；MW~150 kDa）外，还含有两个较小的免疫球蛋白（IgG2和IgG3；MW~90 kDa），它们缺乏轻链和第一个重链恒定结构域（重链抗体或HCAbs），共占血清IgG总量的75%（图1）。随后对其他骆驼科动物（美洲驼和羊驼）的研究表明，HCAbs存在的浓度较低（25-50%）。最重要的是，在本报告中，通过放射免疫沉淀和印迹试验，从暴露于伊氏锥虫的单峰骆驼上证明了HCAbs的抗原结合活性。

抗体基因克隆研究揭示了HCAbs可变结构域的独特序列。为区别于传统的VH结构域，使用“VHH”来表示骆驼科的可变结构域。随后，使用溶菌酶和破伤风类毒素两种模型抗原免疫的单峰骆驼序列构建了噬菌体展示VHH文库，以检验通过噬菌体筛选分离骆驼VHHs的可行性。经过四轮筛选，分离并鉴定出了对溶菌酶和破伤风类毒素具有纳摩尔亲和力的VHHs。通过尺寸排除色谱法证明了VHH的可溶性，显示VHH是单体，没有聚合的倾向。圆二色光谱（在197-215 nm之间）显示了VHH如预期的Ig β-折叠的结构（图1c）。

【内容介绍】

1.骆驼科VHHs的结构

解析VHH和VHH-溶菌酶复合物的载脂蛋白晶体结构揭示了抗溶菌酶VHH相当独特的特征，其中CDR3的N端片段渗透到溶菌酶的催化位点，CDR3 C端折叠在VL前界面上，屏蔽了VHH中一些剩余的疏水区域（例如Phe 42）。更多的结构研究表明，除了识别酶活性位点和蛋白质表面的其他空腔外，VHH-抗原还有许多其他的相互作用，包括VHH识别蛋白质上的平面，甚至形成凸互补位以提高与小分子和半抗原结合的能力。

为了全面了解VHH与抗原之间的相互作用，最近一项对105个VHH-抗原晶体结构（分辨率