1   酵母双杂实验方法

2.1 酵母快速转化（单转&双转）

2.1.1实验材料

1)YPAD的平板；50mL YPAD的培养液（250的锥形瓶;）SD平板;

2)使用前不要灭菌的：10mg/μL ssDNA; YH2Gold的原始酵母菌株；96孔板；

3)使用前要灭菌的：

50%(W/V) PEG3500；1ML liAc；，50%(W/V) C6H12O6; d2H2O; 1.5ml离心管; 50ml离心管;镊子；黄枪头；蓝枪头；白枪头；30-60%的甘油；

2.1.2实验步骤

1)从-80℃的冰箱中取出YH2Gold的原始酵母菌株，在YPAD的平板上划线，放置在30℃的培养箱中，培养2-3天。

2)2-3天后，将划线的平板上，取出。将50mL的YPAD的培养液中加入2mL 50%的C6H12O6，摇匀后，吸取1mL的培养液加入1.5ml离心管，备用。

3)用黄枪头挑选一个直径不小于2mm的酵母菌落，将其刮在含有YPAD溶液的1.5ml离心管中，在涡旋仪上振荡1min，直到将酵母菌落打散。（注意：振荡这一步特别重要，酵母菌落有较多粘稠的液体，会使酵母菌聚集在一起，使其生长变得缓慢！）

4)将离心管中的菌液吸取到50mL的YPAD的培养液中，封好，放置在30℃，200-230rpm/min的摇床，过夜。（一般16小时左右即可进行下面的实验）

5)从过夜的培养液中吸取1.4mL到1.5ml离心管中，用离心机最大转速离心30s,弃上清，重复一次，即收集2.8mL培养液中的菌体。（一般情况下，一个转化同时做2管！）

6)向1.5ml离心管中菌体加入700mL的双蒸水，在涡旋仪上振荡1min，直到将酵母菌落打散。（注意：清洗这一步特别重要，酵母菌落有较多粘稠的液体，会使酵母菌聚集在一起影响转化效率！）。

7)用离心机最大转速离心30s,弃上清。

8)按照如下顺序加溶液：

50%(W/V) PEG3500

240μL

1ML liAc

36μL

10mg/μL ssDNA

10μL

质粒

4μL

d2H2O

70μL

总体积

360μL

  如果是共转的情况，每个质粒加4μL，d2H2O只加66μL。

  （注意：ssDNA在使用前，必须99℃加热10min,然后冰浴10min，在加ssDNA前必须振荡混匀!）

9)将上面步骤中所有液体加好后，在涡旋仪上振荡1min，使其充分混匀。

10)42℃水浴1小时，每隔10min，将离心管轻轻的上下颠倒几次。（这一步的目的是为了防止菌夜沉入管底，影响转化效率！）

11)用离心机最大转速离心30s,弃上清,加入200μL的d2H2O，在涡旋仪上振荡1min，使其充分混匀。

12)将200μL菌液涂在对应的单缺或者双缺的SD平板上。放置在30℃的培养箱中，培养2-3天。

13)将平板上长出的酵母菌，挑选几个长势优良的，划在另一块新的SD平板上，进行扩大培养。（这一步主要是方便后面进行mating！）

14)将正确的菌用30-60%的甘油进行-80℃存放。同时如果不确定质粒是否转对，可以进行对应的酵母菌液PCR。

1.2     Mating（多用于筛库）

2.2.1实验材料

1)SD培养基（已经加好了对应的葡萄糖和Dropout 溶液）:

50块SD/-Trp-Leu-His-Ade平板（150mm）（一般提前2天倒好，放在超净工作台！）;

2块SD/-Trp-Leu平板（90mm）;

2块SD/-Leu平板（90mm）;

2瓶50mL SD/-Trp的培养液

1瓶10mL SD/-Trp的培养液

2)YPAD的培养液（已经加好了对应的葡萄糖）:

  1* YPAD的培养液：50mL

  0.5* YPAD的培养液：2瓶50 mL，2瓶10 mL;

  2* YPAD的培养液：2瓶45 mL，2瓶10 mL ;

3)使用前需要灭菌的： 1.5ml离心管; 50ml离心管；2L的锥形瓶，黄枪头；蓝枪头；白枪头；50%(W/V) C6H12O6; d2H2O;镊子；

4)使用前不需要灭菌的：96孔板；含有bait的Y2HGold的酵母菌株；50μg/mL kanamycin solution ；载玻片；盖玻片；酵母文库；

2.2.2实验步骤

1)吸取1mL SD/-Trp的培养液加入1.5ml离心管，备用；

2)单转得到含有bait的Y2HGold的酵母菌株，（承接2.1.2中的13）的内容）,在活化的从平板上，用黄枪头挑选一个直径不小于2mm的酵母菌落，将其刮在含有SD/-Trp溶液的1.5mL离心管中，在涡旋仪上振荡1min，直到将酵母菌落打散。（注意：振荡这一步特别重要，酵母菌落有较多粘稠的液体，会使酵母菌聚集在一起，使其生长变得缓慢！）

3)将离心管中的菌液吸取到SD/-Trp的培养液中，封好，放置在30℃，200-250rpm/min的摇床，过夜。直到OD值到达0.8（16-20小时）。（注意：根据实验经验，OD值在0.75-0.8之间的mating效率最好！）

4)用50 mL离心管收集菌液， 1000g/min ,离心3min, 弃上清。

5)从10mL SD/-Trp的培养液吸取1-2mL，悬浮菌体，加入2L的锥形瓶中。

6)按照上一步，重复悬浮两次，确保大部分菌体都加到2L的锥形瓶中。

7)向45 mL 2* YPAD的培养液加入50μL 50μg/mL Kanamycin，向10 mL 2* YPAD的培养液加入10μL 50μg/mL Kanamycin。

8)将融化（注意：因为酵母文库放在-80℃冰箱，提前半个小时将其取出，都放在冰上融化后，在放置在室温10min以上！）的酵母文库吸取10μL进行梯度实验，其余的酵母文库都加到2L的锥形瓶中。

文库梯度实验：

a:   将10μL菌液加到990μL d2H2O，振荡1min；

b：从a吸取100μL液体到900μL d2H2O，振荡1min；

c：从b吸取100μL液体到900μL d2H2O，振荡1min，吸取100μL液体涂在SD/ -Leu平板;（浓度：1*10-5mL）；

d:   从c吸取100μL液体到900μL d2H2O，振荡1min，吸取100μL液体涂在SD/- Leu平板;（浓度：1*10-6mL）；

将2块SD/ -Leu平板放置在30℃的培养箱中，培养2-3天。

9)从10 mL 2* YPAD的培养液（加有Kanamycin）吸取1mL, 悬浮菌体，加入2L的锥形瓶中

10)按照上一步，重复悬浮两次，确保文库都加到2L的锥形瓶中。（注意：尽量使用同一个枪头文库中所有的菌液都加到2L的锥形瓶，不然会影响双杂效果！）

11)将45 mL 2* YPAD的培养液（加有Kanamycin）加到2L的锥形瓶中，封好。

12)放置在30℃，30-50rpm/min的摇床，过夜。（20-24小时）。

13)20小时后，可以取10μL的mating菌液,放在显微镜（40*）下检测，观察是否大规模的出现了像“米老鼠的脸”这样的两个酵母粘在一起的现象，如果出现可以进行下一步，如果没有，则继续在摇床上培育4小时。（一般为了防止菌液的浪费，只有第一次mating时，进行镜检，如果第一次筛库成功，第二次至最后一次筛库，可以不需要镜检！）

14)向2瓶50 mL 0.5* YPAD的培养液加入50μL 50μg/mL Kanamycin，向10 mL 0.5* YPAD的培养液加入10μL 50μg/mL Kanamycin。

15)用50 mL离心管收集mating菌液，编为1号离心管；然后用50 mL 0.5* YPAD的培养液（加有Kanamycin）冲洗2L的锥形瓶，收集冲洗的菌液，编为2号离心管；再重复冲洗一次，收集冲洗的菌液，编为3号离心管。

16)将3瓶菌液，1000g/min ,离心3min, 弃上清。

17)从10 mL 0.5* YPAD的培养液（加有Kanamycin）吸取0.8 mL, 悬浮3号管中菌体，加到1号管中，再重复二次，加到1号管。（注意：尽量使用同一个枪头！）

18)按照上一步，悬浮2号管，加到1号管，再重复二次，加到1号管。（注意：这样做可以尽量减少菌液的损失，减少对酵母双杂的结果的影响！并且尽量使用同一个枪头！）

19)再将1号管的菌液悬浮起来，将10 mL中剩下的 0.5* YPAD的培养液加到1号离心管中，混匀，吸取10μL进行梯度实验。将剩下的菌液涂到50块SD/-Trp-Leu-His-Ade平板（150mm）。（每次涂布前，吸取的菌液要混匀，涂布的过程尽量快速，因为菌液干的比较快！）

mating梯度实验：

a:   将10μL菌液加到990μL d2H2O，充分混匀, 吸取100μL液体涂在SD/-Trp-Leu平板;（浓度：1*10-4mL）；

b:从a吸取100μL液体到900μL d2H2O，充分混匀后，吸取100μL液体涂在SD/-Trp-Leu平板;（浓度：1*10-5mL）

将2块SD/-Trp-Leu平板放置在30℃的培养箱中，培养2-3天。

20)将50块SD平板放置在30℃的培养箱中，培养5-15天。

2.2.3 mating效率计算

由于本人数学不佳，直接采取举例的方法：

公式：

效率=1 mL mating菌液中菌的数目/1 mL文库中菌的数目*100%

假设：

在文库梯度实验中，在浓度为1*10-5mL的平板上有200个菌落；在浓度为1*10-6mL的平板上有34个菌落；取200为有效数字，则1 mL文库中菌的数目为：2*107个。

在mating梯度实验中，在浓度为1*10-4mL的平板上有100个菌落；在浓度为1*10-5mL的平板上有7个菌落；取150为有效数字，则1 mL mating菌液中菌的数目为：1*105个。

则mating效率为1*105个/2*107个*100%=5%

（注意：酵母筛库成功的检验方法：在文库酵母数目大于2*107个的前提下，mating效率大于2%，即本次筛库过程中，发上了共转的酵母超过1百万个！）

1.3    筛到酵母检测

2.3.1实验材料

1)SD培养基（已经加好了对应的葡萄糖和Dropout 溶液）:

SD/-Trp-Leu-His-Ade平板（150mm）

SD/-Trp-Leu-His-Ade平板（90mm）

SD/-Trp-Leu/ X-α-gal平板（90mm）

SD/-Trp-Leu/平板（90mm）

10mL SD/-Trp-Leu的培养液

2)使用前需要灭菌的： 1.5ml离心管; 50ml离心管；黄枪头；蓝枪头；白枪头；50%(W/V) C6H12O6; d2H2O;镊子；

2.3.2实验步骤

1)将四缺平板上筛库得到的阳性克隆，划在另一块新的SD/-Trp-Leu/平板（90mm）上，进行扩大培养。

2)吸取1mL d2H2O加入1.5ml离心管，备用。

3)从扩大培养的平板上，用黄枪头挑选酵母菌落，将其刮在含有d2H2O的1.5mL离心管中，在涡旋仪上振荡1min，直到将酵母菌落打散。

4)测定对应的OD值，根据不同的检测方法，将菌液稀释到对应的OD值

 （注意：检测酵母阴阳性的时候，一般采用点菌的方法，一般是吸取5μL的菌液点在平板上，因为酵母的浓度，会对结果的判断产生影响，尤其是X-α-gal的显色实验！）

a.四缺平板梯度实验：

  一般将浓度稀释成OD值：0.2,  0.02,  0.002,0.0002进行点菌，放置在30℃的培养箱中，培养3-5天。

  如图所示，为点菌72小时后的结果：

b. SD/-Trp-Leu/ X-α-gal平板实验：

一般将浓度稀释成OD值：0.2和0.5进行点菌，置在30℃的培养箱中，培养1-3天。（注意：由于X-α-gal需要避光，操作时尽量快速，平板可以用锡箔纸包着，再放到培养箱！阳性和阴性对照是必须的！）

5)将正确的酵母菌用30-60%的甘油进行-80℃存放。

1.4    酵母质粒的提取

2.4.1实验材料

1)10mL SD/-Trp-Leu培养液（50的锥形瓶）（已经加好了对应的葡萄糖和Dropout 溶液）;

2)使用前不要灭菌的： 96孔板；5U/μL溶壁酶；20%SDS;小提试剂盒；

3)使用前要灭菌的：

50%(W/V) C6H12O6; d2H2O; 1.5ml离心管; 50ml离心管;镊子；黄枪头；蓝枪头；白枪头；30-60%的甘油；

2.4.2实验步骤

1) 吸取1mL SD/-Trp-Leu的培养液加入1.5ml离心管，备用。

2)用黄枪头挑选一个直径不小于2mm的酵母菌落，将其刮在含有SD/-Trp-leu溶液的1.5mL离心管中，在涡旋仪上振荡1min，直到将酵母菌落打散。（注意：振荡这一步特别重要，酵母菌落有较多粘稠的液体，会使酵母菌聚集在一起，使其生长变得缓慢！）

3)将离心管中的菌液吸取到SD/-Trp-leu的培养液中，封好，放置在30℃，200-250rpm/min的摇床，过夜(16-24小时 )。

4)从过夜的培养液中吸取0.5mL到1.5ml离心管中,加入30-60%的甘油，进行-80℃存放。

5)从过夜的培养液中吸取1.4mL到1.5ml离心管中，用离心机最大转速离心1min,弃上清，重复一次，即收集2.8mL培养液中的菌体。

6)向1.5ml离心管中菌体加入700mL的双蒸水，在涡旋仪上振荡1min，直到将酵母菌落打散。（注意：清洗这一步特别重要，酵母菌落有较多粘稠的液体，会使酵母菌聚集在一起，不能充分结合溶壁酶，从而影响质粒提取效率！）。

7)用离心机最大转速离心1min,弃上清,使剩余的液体大约50μL。

8)加入10μL的5U/μL溶壁酶 （Sigma, L2524），在涡旋仪上振荡1min，放在37℃摇床，200-250rpm/min,摇1小时。（注意：酵母细胞壁的厚度约为0.1-0.3微米，其主要组成部分为D-葡聚糖和D-甘露聚糖，所以破壁特别重要！而且以上操作都在超净工作台！）

9)加入10μL的20%SDS，在涡旋仪上振荡1min，放在-20℃，至少20min。

10)在涡旋仪上振荡1min，按照小提试剂盒的步骤，加Buffer E1直到总体积为250μL。

11)按照小提试剂盒的步骤，加250μL Buffer E2，静置10min。（静置特别重要，因为酵母的细胞壁太厚了！）

12)接下来的步骤全部按照小提试剂盒来操作。

13)将10μL的质粒转到DH5α的感受态中，再从DH5α提取质粒，送测序。

（注意：如果觉得上述步骤很繁琐，你可以购买酵母质粒提取试剂盒!）

1.5    酵母对照实验

阳性对照：Y2HGold [pGBKT7-53] & Y187 [pGADT7-T]

阴性对照：Y2HGold [pGBKT7-Lam] & Y187 [pGADT7-T]

检测是否存在自激活现象：

pGBKT7/Bait + Empty pGADT7, 是否使X-α-gal的平板变蓝，没有变蓝（菌落周围的培养基没有变蓝），则不存在这种现象。