前言

抗体在癌症的治疗和诊断中已经证明了其价值，现在可作为一线疗法来治疗某些癌症。一类源于骆驼科的独特抗体片段——纳米抗体，近年来作为诊断工具越来越被接受，也被认为是CAR-T和靶向药物递送的重要基础。纳米抗体的小分子量(约15 kDa)、稳定性、易于制造和修饰、循环半衰期短、高组织穿透性，以及出色的特异性和亲和力，是它们的吸引力所在。本文将分上下节阐述纳米抗体在肿瘤生物学领域的应用。

1 简介

针对癌症的自发或工程化免疫反应被视为其他疗法的有力辅助手段。抗原呈递细胞(APC)、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B细胞共同调节适应性免疫，CD4+ T细胞（辅助T细胞）在识别APC表面MHC-II分子上呈递的抗原时做出反应，活化的辅助T细胞及其产物通过激活B细胞、NK细胞和巨噬细胞来增强适应性免疫反应。B细胞通过MHC-II呈递抗原，MHC-II被辅助T细胞识别，然后辅助T细胞分泌信号将B细胞分化为分泌免疫球蛋白 (Ig) 的浆细胞。Ig有多种用途，譬如中和传染原、增强吞噬作用或补体辅助破坏病原体等。这些效应器功能主要归因于片段结晶(Fc)受体的交联。在大多数哺乳动物中，Igs由一条重链和一条轻链组成，每条链都包含一个可变区和一个恒定区。

1989年科学家在鲨鱼和骆驼科动物中发现了一种独特的缺乏轻链的Igs。对骆驼体内重链抗体(hcAbs)的可变区进行克隆后，得到单域抗体(sdAb)片段，也称为纳米抗体(Nb)或VHHs（图1A）。尽管只有传统单克隆抗体分子量的1/10左右，纳米抗体仍保留了抗原特异性和结合亲和力的特征。此外，纳米抗体特有的溶解性和稳定性，以及易于在细菌中生产，从而实现大规模生产等特征使其越来越多地用于各个领域，例如药物或放射性同位素的输送，以及肿瘤和其他组织类型的成像。本文重点关注纳米抗体在肿瘤免疫学中的最新应用，涵盖肿瘤的诊断、成像和治疗。

2 纳米抗体相关肿瘤靶点

纳米抗体与传统抗体具有相似的抗原结合特性。然而，由于纳米抗体使用单个Ig可变域进行抗原识别，它们可以访问常规抗体或抗体衍生物（如scFv）无法达到的表位，如可以穿透蛋白表面或域-域介质的缝隙中。图1B显示了与肿瘤（微环境）相关的纳米抗体靶点，文末表1汇总了目前可用于肿瘤相关靶点的纳米抗体。

在某些情况下，纳米抗体与来自其他物种的同源目标发生交叉反应。这可能有助于从临床前应用到临床应用的过渡。例如，抗EGFR纳米抗体8B6[1]、抗HER2纳米抗体2Rs15d[2]和针对纤连蛋白EIIIB剪接变体的纳米抗体与人和鼠抗原的交叉反应[3]。

图 1. 纳米抗体及其与肿瘤（微环境）相关的靶点

2.1 EGFR家族

表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员通常过表达于上皮来源的肿瘤细胞表面，并在其增殖、存活和血管生成中发挥作用。靶向EGF受体的抗体已在癌症治疗中被证明是成功的。譬如商品化产品西妥昔单抗，就是一种特异性结合EGFR的人鼠嵌合单克隆抗体。由此，EGFR家族成员也成为纳米抗体靶向的首批肿瘤标志物之一。以EGFR1为靶点的纳米抗体通过噬菌体展示鉴定，使用与配体EGF的竞争性洗脱来鉴定特定结合物，使用相同的EGFR噬菌体纳米抗体库并选择EGFR胞外域，研究者鉴定出了纳米抗体7C12、7D12[4]和9G8[5]。其中7C12和7D12与西妥昔单抗竞争。

多价纳米抗体分子可以通过融合单个纳米抗体基因片段或通过化学偶联方法构建。EGFR特异性纳米抗体以不同的组合形式形成二价分子，所有这些都抑制了体外表皮样癌模型中的肿瘤细胞增殖。具体而言，7D12-9G8抗EGFR纳米抗体的组合在抑制EGFR信号传导和减少人表皮样癌A431细胞的生长方面表现最佳。当与血清白蛋白结合纳米抗体Alb1连接时，该结构被称为CONAN-1，它强烈抑制EGF诱导的信号传导，导致A431异种移植小鼠的肿瘤消退[6]。

使用类似的方法，其他研究者还获得了抗EGFR纳米抗体8B6和OA-cb6[7]，此外，识别EGFR家族的另一个成员HER2的纳米抗体被证明特异性靶向HER2+SKOV3卵巢癌细胞来源的肿瘤[8]。靶向HER2的纳米抗体11A4[9]和5F7GGC[10]已用于各种（临床）应用。

2.2 VEGFR2和VEGF

血管上皮生长因子受体2(VEGFR2)是人类VEGFR受体家族的一部分，存在于血管内皮细胞上。其配体VEGF由巨噬细胞和肿瘤细胞等细胞类型分泌，从而诱导下游信号通路参与细胞增殖、血管生成和转移，这使得VEGF和VEGFR2成为基于纳米抗体的疗法的诱人靶点，例如，VEGF（VEGFR）靶点抗体通过特异性结合VEGF（VEGFR），从而抑制下游信号通路，实现抑制血管生成。

抗VEGFR2纳米抗体3VGR19通过噬菌体展示在VEGFR2受体的重组胞外域上获得，它可以抑制VEGFR2信号传导，从而抑制毛细血管样结构的形成，这在一项关于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)[11]的体外研究中得到了证实。

中国研究者从HuSdl™中分离出抗血管生成VEGFR2-D3特异性纳米抗体NTV1[12]，HuSdl™是“驼源化”人抗体的人单域抗体库。以类似的方式，VEGF纳米抗体也被获得。这些纳米抗体在使用HUVEC的体外血管生成实验中抑制了内皮细胞增殖。其中之一的人源化版本Nb42[13]也已产生。另有研究特异性靶向VEGF-A结合域的纳米抗体VA12[14]在绒毛膜尿囊膜实验中显示出抗血管生成的潜力。

2.3 c-Met和HGF

肝细胞生长因子(HGF)与c-Met受体结合，可激活导致癌症进展、血管生成和转移的通路。对于几种不同的上皮和非上皮癌，HGF和c-Met受体的过表达与预后不良结果相关，目前靶向c-Met和HGF的纳米抗体已经生产出来。Schmidt Slørdahl等人使用了一种双特异性纳米抗体，其中一种纳米抗体靶向c-Met，另一种纳米抗体能够与人血清白蛋白结合以延长半衰期。这种双特异性抗c-Met纳米抗体抑制了c-Met与HGF的相互作用，并导致多发性骨髓瘤细胞中细胞迁移和粘附减少，在抑制肿瘤生长方面这种双特异性纳米抗体比传统的二价抗c-Met单克隆抗体更有效[15]。

Jo Vercammen等人报告了两种名为 1E2 和 6E10 的 αHGF-纳米抗体显示出对HGF诱导的Bx-PC3人胰腺癌细胞增殖的剂量依赖性抑制。用抗HGF纳米抗体处理携带人神经胶质瘤U-87MG异种移植的裸鼠，与对照组相比，抗HGF纳米抗体显著抑制了肿瘤的生长[16]。上述两种纳米抗体都显示出作为多发性骨髓瘤和其他HGF-c-Met驱动型癌症的治疗潜力。

2.4 其他靶点

除上述分子外，许多其他肿瘤相关抗原也被作为纳米抗体开发的靶点。趋化因子受体，即G蛋白偶联受体(GPCR)，在多种恶性肿瘤中过表达。趋化因子及其受体驱动与先天性和适应性免疫反应相关的各种细胞类型的迁移和激活。如果目标是干扰细胞迁移，鉴于纳米抗体的卓越组织渗透性，这些分子将是理想的靶点。靶向GPCR及其配体的纳米抗体包括对人CXCR2、CXCR4、CXCR7、CXCL11和CXCL12以及病毒GPCRUS28的试剂。

此外，已经鉴定出靶向人类肿瘤相关（跨）膜蛋白的纳米抗体，例如癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)以及人和鼠巨噬细胞甘露糖受体(MMR)。

免疫细胞标志物也属于重要在研靶点，如人CD7、人和鼠CTLA-4、人和鼠PDL-1、鼠CD8、鼠CD11b、人CD20、人CD38、鼠CD45、鼠Ly-6C/Ly-6G、人和鼠MHC-II。其他靶点还包括纤连蛋白、TUFM、CapG、CAIX、CD33、人和鼠CD47、鼠ARTC2和TNFα（表1）。

抗体的肿瘤相关靶点，除了靶点研究外，纳米抗体还越来越多地被用作分子成像技术的诊断工具，如PET、SPECT和近红外荧光成像，早期的临床试验也证明了这一点。更重要的，作为治疗剂，纳米抗体可以帮助药物或放射性同位素的传递，以及用于肿瘤疫苗和CAR-T细胞治疗，具体将在下一章阐述。