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我现在在做重叠PCR，第一步PCR后，胶回收。命名A，BA：371 bp；B：670 bp然后：25微升体系（A：50ng，B：50ng，dNTP：0.4uM/ul，pfu：0.3uM）然后：95度，3min， 95度，1min 65度，1min 72度，2min 72度，10min5个循环。 然后再加入25微升补充体系，（dNTP：0.4uM/ul，pfu：0.3uM，上下游引物各：0.1uM/ul）混合成50微升体系在进行30个循环，按以上体系。但是P出来的都是糊的，没有特异性条带。中间重叠部分引物如下：Middle 1: 5’-TAAGAGTCGTCCCGTGTAGCAAGACCTTCCATCATCG-3’ tm=80.4Middle 2: 5’- CTACTACCTTCCAGAACGATGTGCCCTGCTGAGAATAC -3’ tm=77.6 高手看看有什么问题么？谢谢 建议按以下体系及循环参数作A：371 bp；B：670 bp然后：25微升体系（A：50ng，B：50ng，dNTP：0.4uM/ul，pfu：0.3uM，聚合酶buffer ）然后：95度，4min，94度，55s65度，40s72度，1min5个循环。72度，2min然后在72度，2min的过程中就再加入25微升补充体系，（dNTP：0.4uM/ul，pfu：0.3uM，聚合酶buffer,上下游引物各：0.1uM/ul）混合成50微升体系95度，4min，94度，50s65度（最好退火温度比65高或低），40s72度，1min30循环。72度，10min基本上同意楼上的意见，你的片段又不长，延伸1min足矣，退火时间减少可以减少非特异反应，还不行，建议做一下梯度，摸摸退火温度。还有一个问题，我个人认为，pfu的效果不是很好，我曾经因为这个酶耽误了很长时间，一直就是非特异性条带，摸条件花了很长时间。后来换了酶扩出来的条带很清楚。我因此发誓再也不用Pfu了。呵呵可是我是要作克隆的，这个片段总长也有1k多了，taq怕保真度不够吧。经检查，使中间重叠部分的引物设计错了。：（低级错误，不过还是感谢各位前辈。对了还想问一下，中间重叠部分设计多少为好？因为如果是40个重叠的话，那和两边配对的概率是一样的。这样不是第一步P模版的时候就会出错配条带。
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