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作者：

刘红芝

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摘要：

酵母细胞壁占细胞干重的20-25%,甘露聚糖存在于酵母细胞壁外层,占细胞壁干重的40%左右,赋予细胞生物学活性和控制细胞壁孔径.甘露聚糖是免疫功能最强的酵母细胞壁多糖,它能增加动物体液免疫和细胞免疫能力,调节肠道菌群平衡,结合吸附外源性病原菌,并具有抗辐射,抗氧化,抗肿瘤等活性功能. 本研究对不同酿酒酵母菌种的甘露聚糖含量进行了分析对比,结果表明酵母中甘露聚糖含量随其菌种不同而有明显差异(p0.05).原有从中科院微生物研究所购得菌株AKU 2.1424生物量最高,达905.02±9.91 mg/100ml;AS 2.0016甘露聚糖含量及其占细胞干重比率最高,分别为76.21±0.73 mg/100ml与12.92%."实践8号"卫星搭载后的酿酒酵母样品,经过筛选得到的菌株AS 2.0016-M生物量增加46.69%,细胞壁占酵母干重比率增加3.81%,细胞壁厚度增加62.62%,甘露聚糖含量增加18.82%,β-葡聚糖含量增加146.87%,各指标均较原菌株增加达极显著水平(p0.01). 对酿酒酵母AS 2.0016的发酵条件进行了优化.首先进行了单因素实验的研究,并在此基础上,以二次正交旋转组合设计试验,得到培养基模型方程为: 经二次多项式逐步回归分析确定了最佳培养基:蔗糖4.98 g/100ml,大豆蛋白胨4.39 g/100ml,酵母膏3.10 g/100ml,甘油2.21 g/100ml.使用优化后培养基得到的甘露聚糖由优化前的85.72±3.38 mg/100ml增加到162.53±3.47 mg/100ml,提高了96.48%.应用正交优化方法对培养条件进行优化,得出各因素对酵母甘露聚糖量的影响因素依次为:装液量温度起始pH接种量.酵母最适的培养条件为:pH值5,接种量5 ml,温度32℃,装液量40 ml.对最佳培养条件进行验证试验,酵母甘露聚糖产量达到268.30±1.94 mg/100ml,较发酵条件优化前的162.53±3.47 mg/100ml,提高了65.08%.对热水抽提与碱法制备酿酒酵母甘露聚糖的工艺进行了优化,确定水提法制备甘露聚糖的最佳条件为:浓度25%(w/w)的酵母菌体在pH值6.5,3% NaCl和50℃的条件下振荡自溶24 h;然后将自溶后的菌体洗净,120℃处理3 h.碱提法制备酵母甘露聚糖的最佳条件为:KOH浓度2%,温度100℃,反应时间2 h.使用TCA去除酵母甘露聚糖中蛋白,蛋白脱除率可达70.94%.去蛋白后经两次醇沉,第一次乙醇浓度50%,复溶离心后使用体积分数为70%的乙醇进行二次醇沉.通过工艺条件优化,WSMP与ASMP粗品得率分别为6.42%与5.93%,纯度分别为81.32%与88.24%.通过凝胶过滤色谱纯化WSMP与ASMP,产品最终纯度达92.61%与93.31%. 用HPLC测定WSMP与ASMP的平均分子量分别为1.81127×10~5 Da与6.5098×10~4 Da.采用GPC-LLS测定酵母甘露聚糖WSMP和ASMP的绝对分子质量,得到WSMP的重均分子质量(Mw)为1.667×10~5 Da,ASMP的重均分子质量为6.620×10~4 Da.WSMP的多分散系数为1.350,ASMP的多分散系数为1.17,二者均在1.5以下,说明两个样品的分子质量分布较为集中.单糖组成测定表明,酵母甘露聚糖主要由甘露糖组成,氨基酸分析表明,酵母甘露聚糖WSMP含有17种常见氨基酸,其中能够构成O-糖肽键的苏氨酸和丝氨酸有较高的比例,分别占总量的20.08%和11.46%,天冬氨酸(Asp)含量较高,占氨基酸总量的14.96%.通过β-消除反应,紫外光谱分析,氨基酸组成分析,气相色谱分析等手段,得出酵母甘露聚糖有N-糖肽键与O-糖肽键两种连接方式,且以N-糖肽键为主要连接方式.通过高碘酸氧化与Smith降解分析,采用FTIR和NMR测定,得出酵母甘露聚糖以α-(1,6)为主链,此外还含有大量α-(1,2)糖苷键.推测酵母甘露聚糖糖链结构为:通过原子力显微镜观察酵母甘露聚糖的立体形貌特征,看出WSMP是由许多小的圆形颗粒形成紧密的网络状结构,存在不同程度的聚集,ASMP聚集成近棒状.扫描电镜观察看出,甘露聚表面呈特征性胶联,聚集态的无定形结构. 通过动物免疫增强试验,检测了WSMP,WSM和ASMP对脾淋巴细胞增殖反应,绵羊红细胞诱导小鼠迟发型变态反应(DTH),小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞等的影响.结果显示:WSMP高,中,低剂量组,WSM中,低剂量以及ASMP中剂量组可显著促进脾淋巴细胞增殖(p0.05).WSMP,WSM和ASMP均能增强绵羊红细胞诱导的小鼠迟发型变态反应,即可增强细胞免疫功能,其中以WSM的促进作用最为明显.低剂量的WSMP以及中,低剂量的WSM能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬功能(p0.05).通过体外抗肿瘤实验,得出WSMP在1.666 mg/ml时能够抑制50%的HL-60肿瘤细胞,WSM也具有直接抑制HL-60生长的作用,但其活性略低于WSMP.体外抑制Eca-109与HepG2细胞生长实验结果显示,WSMP与WSM对这两种肿瘤细胞均有一定的抑制效果,WSMP作用效果优于WSM.ASMP体外无抗肿瘤作用.

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关键词：

酿酒酵母 甘露聚糖 发酵 制备 结构鉴定 免疫活性

被引量：

11

年份：

2009