山西科技

SHANXI

SCIENCE

TECHNOLOGY

2020

年

第

35

卷

第

2

期

人凝血因子

Ⅶ

（

Human

coagulation

factor

Ⅶ

，

hFⅦ

）

是微生素

K

依赖的丝氨酸蛋白酶，

在人体内是以

406

个

氨基酸的酶原形式存在，

以激活的

hFⅦ

（

activated

hF

Ⅶ

，

hFⅦ

a

）

参与凝血过程。当血管受损伤时，

组织因子

（

TF

）

暴露，

与

hFⅦ

结合形成

TF/

hFⅦ

a

复合物，

增加

FⅦ

a

对其底物

Ⅸ

和

FⅩ

的蛋白水解活性，

激活内、

外源性凝

血途径。在临床上，

重组人凝血因子

Ⅶ

（

rhFVIIa

）

不仅

适用于先天性和获得性

FⅦ

缺乏症的病人，

而且还适用

于治疗存在

FⅦ

和

FIX

抑制物的血友病病人，

以及血小

板减少症和血小板功能障碍病人的出血、

止血和出血

预防等。

血浆中

FⅦ

的含量非常低，

大约为

200

ng/mL

～

400

ng/mL

，

属血浆微量蛋白，

难以规模化制备。基因重组

技术可以规模化制备天然微量蛋白，

因此开展

hFⅦ

基

因的表达研究具有重要的意义。我们拟克隆人

FⅦ

基

因，

并与

g-

羧基化有关的酶

—

—

GGCX

（

g-

谷氨酰基羧

化酶

）

和

VKORC1

（

维生素

K

环氧化物还原酶复合体亚

单位

1

）

基因构建重组真核表达载体，

转染

HEK293

细

胞，

探索

rhFVIIa

基因在

HEK293

细胞中的表达情况，

为

后续研究

hFⅦ

的生物学特性提供理论基础。

1

材料和方法

1.1

质粒菌株及细胞

pUC19

、

pCAGGS-IRES

、

pEE12.4

和

pcDNAOri⁃

pure-hFⅦ

质粒本研究室保存，

E.coli

DH5α

和

HEK293

细胞本研究室保存。

1.2

主要试剂及仪器

TRIzol

Reagent

、

T4

连接酶、

限制性内切酶和质粒

──────────

*

基金项目：

山西省重点研发计划项目

（

201603D

321108

）

。

**

通信作者：

赵

邑，

男，

山西省生物研究院有限公

司研究员，

E-mail

：

*****************

。

文章编号

：

1004-6429

（

2020

）

02-0017-05

收稿日期

：

2020-01-06

重组人凝血因子

Ⅶ

在

HEK293

细胞中的瞬时表达

*

张全爱，

赵峰梅，

曹鹏程，

潘薇薇，

赵亚蕊，

王伟霞，

赵

邑

**

（

山西省生物研究院有限公司，

山西太原，

030006

）

摘

要

：

［目的］在

HEK293

细胞中表达人凝血因子

Ⅶ

（

human

coagulation

factor

，

hFⅦ

）

蛋白。

［

方法

］通过

PCR

分别扩增与

hFⅦ

羧基化有关的酶

（

γ-

谷氨酰基羧化酶

（

GGCX

）

和维生素

K

环氧化物还原酶复合体亚单位

1

（

VKORC1

）

）

基

因

序

列

，

与

hF

Ⅶ

基

因

片

段

构

建

真

核

表

达

载

体

pCAE-

VKORC1-GGCX-hFⅦ

，

利用脂质体将表达载体转入

HEK293

细胞，

采用

Western

blotting

和

ELISA

方法检测细胞上清中

hFⅦ

的表达水平，

凝血因子

Ⅶ

检测试剂盒测定

hFⅦ

的促凝血活性。

［

结果

］

Western

blotting

检测细胞

上清中含有

hFⅦ

蛋白，

经

ELISA

检测表达量为

12

mg/L

，

凝血因子

Ⅶ

检测

试剂盒测定

hFⅦ

的促凝血相对比活性为

612%

。

［

结论

］该表达载体成功

在

HEK293

细胞中瞬时表达

hFⅦ

蛋白，

为进一步深入研究

hFⅦ

的生物学

特性奠定了基础。

关键词

：

人凝血因子

Ⅶ

；

γ-

谷氨酰基羧化酶；

维生素

K

环氧化物还原酶复

合体亚单位

1

中图分类号

：

Q78

文献标志码

：

A

17