2．体格检查：

现场测量身高、体重，进行性发育分期评估（Tanner分期）；

3．腹部超声：

（空腹）腹部超声检查；

4．采集血液标本：

调查对象取清晨空腹静脉血2~3 ml（不抗凝），室温静置30 min，离心后吸取上清（血清），分装并保存于－80 ℃，定期将血清标本低温（－20 ℃）转运至中心实验室检测；

5．检测血清标本：

由中心实验室对上述血清标本进行检测，具体检测指标和检测方法为：（1）性激素：雌二醇、睾酮、黄体生成素、卵泡刺激素，采用化学发光微粒子免疫检测法检测；（2）肝功能：丙氨酸转氨酶（alanine transaminase，ALT），同时采用加磷酸吡哆醛、不加磷酸吡哆醛的两种试剂速率法检测；（3）肾功能：肌酐同时采用碱性苦味酸法和酶法检测，胱抑素C采用免疫透射比浊法检测；（4）免疫功能：免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、补体C3和补体C4，免疫透射比浊法检测；（5）其他：碱性磷酸酶采用磷酸对硝基苯法检测，尿酸采用尿酸酶法检测，肌酸激酶采用酶法检测。

上述检验指标采用配套试剂在雅培全自动生化免疫分析仪检测（ARCHITECT cil6200），实验的产品性能验证标准按照说明的要求进行。其中，肌酐（苦味酸法）、ALT（加磷酸吡哆醛及不加磷酸吡哆醛）、碱性磷酸酶、肌酸激酶、尿酸、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、补体C3、补体C4、睾酮、雌二醇、卵泡刺激素和黄体生成素使用伯乐质控品，其余各项使用雅培原装质控品；睾酮、雌二醇、卵泡刺激素和黄体生成素使用三水平质控，其余各项使用两水平质控。每日检测前先运行质控，质控合格后再进行样本检测，批间变异系数见表1。

表1

15项临床检验指标的批间变异系数

上述研究过程中，制定并实施统一的质量控制文件，包括问卷调查、体格检查、腹部超声、血液标本采集、处理、保存、检测的标准操作规程和相应记录文件；各研究中心分别负责问卷调查、体格检查、腹部超声以及血液标本的采集、保存，定期将血清标本转运至负责单位的中心实验室，转运由专人负责、全程干冰运输（－20 ℃），制定并实施统一的样本交接流程、登记表格；负责单位的中心实验室负责（全部）血液标本的检测工作，中心实验室是获得ISO15189和美国CAP双认可的医学实验室。

三、统计学分析1．估算样本量：

根据国际公认的美国临床实验室标准化协会（clinical laboratory standard institute，CLSI）发布的《临床实验室如何确定生物参考区间》C28-A3指南[8]，最小的可靠观测数为120名。考虑到儿童参考区间的特殊性，各项检验指标可能在年龄组间存在较大的异质性，故需要在每个年龄层保证最小可靠观测数120名；本研究调查对象为6月龄~17岁儿童，拟分为17个年龄组，初步估算研究所需样本量为2 040名（120名/层×17个年龄分层）。

2．数据管理：

调查问卷、体格检查和腹部超声的结果采用EpiData3.02数据管理软件进行双录入核查比对，然后根据研究编号将录入内容与血液检测结果合并；根据研究对象的入选、排除标准确定"表观正常儿童"，使用相关数据用于统计分析。

3．数据统计：

（1）计算参考区间：使用参数法计算上述检测指标的参考区间上限和参考区间下限，建立参考区间，即参考值95%的分布范围，采用改良的Box-Cox幂变换公式将参考值转换为高斯正态分布；无法转换为正态分布时使用非参数法计算参考区间（雌二醇、睾酮、黄体生成素）；采用Bootstrap方法、通过50次重复抽样估算参考上限、参考下限的90%置信区间，如果参考下限低于检测的最低定量值，以最低定量值作为下限；（2）确定参考区间分层：应用标准差比值[9]判断是否需要按照性别、年龄对参考区间进行分层，以标准差比值>0.3作为需要进行分层的标准，统计软件采用StatFlex Ver6.0 (Artech Inc,日本)。P女孩），不同于欧洲儿童数据（1岁以后水平稳定、无性别差异）[15]，而与我国、日本报道接近[4, 16,17]，既往国内研究发现0~16岁儿童的血胱抑素C水平存在性别差异[17]，Ichihara等[16]发现日本成年男性的血胱抑素C水平高于成年女性，推测性别差异在亚洲人群明显，可能原因为胱抑素C与BMI、体脂含量（BF%）相关，而后两者在儿童恰存在较明显的性别和年龄差异；（4）性激素方面，同加拿大CALIPER研究相比[3]，我国儿童血雌二醇和黄体生成素较晚出现性别差异（10岁以后），青春期女孩的睾酮水平相对低，而黄体生成素参考值上限相对高，推测也可能与种族差异有关。总之，本研究和欧美儿童的参考区间数据存在一定差异，提示儿童临床检验指标的参考区间存在地区差异或种族差异，国外儿童的研究数据并不适用于我国儿童。

日常实践中，有些检测指标同时存在多种检测方法，本研究特地选择肝肾功能的传统指标ALT、肌酐，采用临床最常用的两种方法进行检测：（1）同时采用加磷酸吡哆醛、不加磷酸吡哆醛的两种试剂速率法检测血ALT：结果显示，加磷酸吡哆醛方法检测出的参考区间高于不加磷酸吡哆醛法，与既往（成人）报道相符[18]；这是由于5'-磷酸吡哆醛是ALT的辅基，加入吡哆醛酸后可以保证血中ALT全部成为有活性的全酶参与反应，因此测定值偏高（与实际情况更接近），2007年国际临床化学联合会（IFCC）推荐首选加磷酸吡哆醛方法检测血ALT。（2）同时采用苦味酸法、酶法检测血肌酐：显示苦味酸法检测得出的参考范围高于酶法，特别是小于等于9岁的儿童，参考范围的上限、下限均高于酶法，这是由于苦味酸法在检测肌酐过程很容易受到白蛋白、免疫球蛋白G和血红蛋白等物质的干扰，特异性相对差，所以在血肌酐水平较低的小年龄儿童检测值偏高[19]。由此可见，即使是同一检测指标，如果采用不同的检测方法其参考范围也有所不同，临床解读检验报告时必须注意所采用的参考范围是否和实际的检测方法相匹配。返回搜狐，查看更多