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2023 年 5 月 12 日，M20 Genomics 团队在知名期刊Nature Communications上以《High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq》为题发表了一种新的基于随机引物的高通量单细胞核测序技术 snRandom-seq，并成功将其应用于对 FFPE 样本的检测。

作为 M20 Seq 技术在福尔马林固定石蜡包埋（formalin fixation and paraffin embedding，FFPE）样本领域的重大应用突破，snRandom-seq 是一种适用于 FFPE 样本，且具有高灵敏度和全长特点的高通量 snRNA-seq 技术。该新方法的面世为实验室和临床 FFPE 标本提供了一个强大的单细胞平台，将极大推动 FFPE 样本或其他低质量的生物样本单细胞核转录组检测，有望应用于更大范围的生物学研究和临床实践中。

图片来源：Nature Communications

单细胞技术应用现状

FFPE 是临床检验、随访主要的样本保存方式，构成了数量庞大且具有巨大价值的临床资料库。

在过去几年中，高通量单细胞（核）转录组测序（scRNA/snRNA-seq）方法已经彻底改变了整个生物医学研究领域。准确鉴定临床 FFPE 样本中每个细胞的转录组学特征，可以更好地理解细胞的异质性和种群动态，进一步提高人类疾病的精确诊断、治疗和预后。但由于 FFPE 制作过程中，RNA 交联、修饰和降解，FFPE 组织单细胞（核）分离及 RNA 捕获仍然具有挑战性。

目前主流的高通量单细胞（核）转录组平台主要依赖 oligo（dT）捕获 RNA 分子 poly（A）尾，不能捕获降解的 RNA，因此局限于检测成熟 mRNA、新鲜或新鲜冷冻的样本。研究人员一直尝试开发各种不同的方法来克服这些挑战。

近期，在 bioRxiv 上发布了两种方法——snPATHO-Seq 和 snFFPE-seq，提供了从 FFPE 组织中分离细胞核进行 snRNA-Seq 的优化方法。snPATHO-Seq 是基于探针的 10 X Genomics 技术，基于已知物种和已知序列设计探针，因此只能检测到有限的基因；而 snFFPE-seq 尝试利用常规的基于 poly（A）的技术路线进行捕获，由于 FFPE 样本中 RNA 发生降解，无法通过捕获 poly（A）的方式获取有效 RNA，因此该方法的灵敏度较低。

随着生物医学发展，对临床标本进行大规模和全面的转录组分析来识别新的预测性生物标志物或罕见的细胞类型的需求越来越迫切。因此，需要一种能够在 FFPE 组织上进行高通量、高灵敏度和高覆盖率的 snRNA-seq 检测方法。

技术原理及流程

snRandom-seq 主要工作流程如图 1 所示。首先，获取的 FFPE 组织进行脱蜡复水、细胞核分离、以及透化。为了避免基因组污染，使用阻断引物与裸露的单链 DNA 结合，通过多次退火和延伸进行原位阻断。然后，随机引物和 oligo（dT）引物进入细胞核与 RNA 结合，对全转录组的 RNA 分子进行原位逆转录。通过末端转移酶（TdT）将 Poly（dA）原位添加到 cDNA 的 3’ 末端。之后，基于 VITACruiser 单细胞平台进行高通量单细胞核标记。最后，进行破乳纯化、cDNA 扩增、二代文库构建以及测序分析。

图 1. 使用 snRandom-seq 技术进行 FFPE 样本检测流程

snRandom-seq 基本性能与技术对比

snRandom-seq 具有非常高的细胞标记特异性，检测 2 000 多个细胞的双胞率仅为 0.3%（图 2a）。同样，UMI 具有非常高的物种特异性（99%）（图 2b），这表明 snRandom-seq 产生了高质量的单核文库。此外，还检测到许多长链非编码 RNA（lncRNA）和短链非编码 RNA（sncRNA），包括核仁小 RNA（snoRNA）、核小 RNA（snRNA）和 microRNA（miRNA）（图2c），表明 snRandom-seq 可以进行全转录组捕获。293T 细胞核中的单核基因中位值是 4 141，UMI 中位值是 11 596，平均测序深度是～29k reads/cell；3T3 细胞核的单核基因中位值是 3 427，UMI 中位置是 9 795，平均测序深度是～25k reads/cell（图 2d，e）。

图 2. 使用人-鼠混合细胞系对 snRandom-seq 进行性能测试

从同一小鼠组织中收集 FFPE 和新鲜样本，并使用 snRandom-seq 比较它们的转录谱（图 3d）。FFPE 和新鲜样本的全转录组谱具有良好的相关性（图 3e）。使用 snRandom-seq 对同一 FFPE 样本进行 2 次独立检测（图 3d），两批基因表达谱具有高相关性（图 3f）。以上结果表明，snRandom-seq 能从 FFPE、新鲜组织中获取相似的、足量信息，且具有可重复性。

将 snRandom-seq 的 FFPE 结果与其他报道的 FFPE snRNA-seq 结果进行比较。从 snRandom-seq 数据中成功鉴定出 FFPE 组织中的数千个细胞核（图 3h），并发现了广泛的 RNA 类型（图 3g），其中 lncRNA 大约是 snFFPE-Seq 方法检出数的 8 倍，而且 snoRNA、scaRNAs 和 miRNA 仅在 snRandom-seq 中检测到。snRandom-seq 检测到的基因中位数均超过 3 000，且数据未饱和，显著高于其他两种高通量 snRNA-seq 方法（图 3h）。

Genebody 分布图显示，基于 oligo（dT）引物的 snFFPE-Seq 显示出明显的 3’ 端偏好；使用 snPATHO-seq 的探针技术（10 X Flex）显示出 5’ 端偏好；而 snRandom-seq 数据 5’-3’ 覆盖均一（图 3j），表明随机引物与 RNA 是均匀结合，额外的 oligo（dT）引物对 FFPE 样本的 RNA 捕获不佳。对于单细胞核水平上的覆盖率，snRandom-seq 的覆盖率远高于 snFFPE-seq 或 snRATHO-seq（10 X Flex）（图 3k）。对于单基因水平上的 RNA 覆盖，C1S、EMG1、KLRG1 三个基因的序列分布图表明了探针技术与随机引物策略存在关键差异（图 3l，附图 8d）。10 X Flex 获取的序列仅限于探针靶区（< 100 bp）；而 snRandom-seq 检测到的序列均匀分布在外显子区和内含子区。

以上结果表明，snRandom-seq 可以捕获 FFPE 组织中更多的 RNA，且基因覆盖度更高。

图 3. snRandon-seq 与其他两种 FFPE snRNA-seq 方法的比较

利用 snRandom-seq 进行 RNA 速率分析

snRandom-seq 在 FFPE 中检测到外显子的同时，还可以检测到内含子序列（图 3b），因此可以用于区分新转录的 RNA（未剪接）和成熟的 RNA（未剪接），更适合于 RNA 速率分析。睾丸中的精子是研究细胞动力学极好的模型，利用 snRandom-seq 进行小鼠睾丸 FFPE 样本的分析，t-SNE 显示了生殖细胞处于连续过渡阶段（主要是早期精母细胞和晚期精母细胞），未分化的精原细胞和成熟的精子细胞分别聚成细胞簇（图 4a）。根据新生转录本计算的速率，展示了各类型细胞中的不同速率矢量方向，特别是在位于早期和晚期精母细胞左侧的细胞中（图 4a，b）。

结合基于基因表达的细胞周期状态分析，RNA 速率分析显示 G2M 期的两个晚期精母细胞亚群上有明显的细胞成熟轨迹，这两个亚群具有活跃的转录活性（图 4c）。

图 4. snRandom-seq 显示 FFPE 小鼠睾丸组织的 RNA 速率分析及细胞周期状态分析

snRandom-seq 在临床肿瘤样本中的应用

1. snRandom-seq 在 MTM 肝癌亚型 FFPE 标本中发现了一个增殖亚群

将 snRandom-seq 应用于一个保存 2 年左右的 MTM 肝癌亚型临床 FFPE 样本（图 5a），获得 5 914 个有效细胞核，单核中位基因数为 3 220、UMIs 为 8 182 个（图 5c），注释出人类肝脏的主要细胞类型（图 5d）。并且从样本中检测到广泛的 RNA 类型，包括 lncRNAs、snRNAs、miscRNAs、miRNAs 和 snoRNAs（图 5f）。其中，一个特定的肝细胞亚群（hepatocyte-2）高表达增殖标记物 MKI67 和其他两个标记物（ASPM 和 TOP2A）（图 5e），大部分细胞处于 G2M 期；hepatocyte-2 与浆细胞之间的通讯有特定的配体-受体对，主要通过 BMP 信号通路接收来自浆细胞的信号（图 5g-i），据报道这与肝癌肿瘤进展相关。综上，snRandom-seq 从临床 FFPE 标本中发现了一个特定的增殖和激活的肝细胞亚群。

图 5. snRandom-seq 在 MTM 肝癌 FFPE 人类标本标本中发现了一个增殖亚群

2. snRandom-seq 在肝癌 FFPE 标本中检测到不同的 lncRNA

对 FFPE 肝癌标本进行 snRandom-seq 检测，获得了较高的基因数和 UMI 数，并鉴定出肝脏的主要细胞簇（图 6b，c）。lncRNA 在以往单细胞转录组研究中总是被忽略。snRandom-seq 数据中肝细胞簇显著表达 lncRNA，且不同肝细胞簇表达的 lncRNA 存在差异，提示可能存在不同的发病机制（图 6d）。snRandom-seq 具有全长转录本覆盖的优势，在癌症生物学的 lncRNA 分析中显示出了前景。

图 6. snRandoy-seq 在人肝癌 FFPE 标本亚群中检测到不同的 lncRNA

3. snRandom-seq 可用于癌症复发性研究

对结直肠癌肝转移（colorectal cancer liver metastases，CRLM）患者的一对初始和复发的 FFPE 临床标本进行了 snRandom-seq 检测。在两个样本中鉴定了主要细胞类型（图 7b、c）。复发样本的 T 细胞的比例更高（图 7d），表明复发样本中有更活跃的抗肿瘤免疫反应。复发样本的主要肿瘤簇（cancer cells-1、2 和 3）的比例持续下降；然而 cancer cells-4 的比例增加（图 7d）。进一步分析发现，编码脂质组成调节因子（SCD）和蛋白结合脂质（APOA2，APOC3 和 APOA1）的基因，在复发样本的 cancer cells-4 中表现出高表达水平（图 7e），表明复发 CRLM 的癌细胞簇中脂质代谢可能增强。

图 7. snRandom-seq 显示了初始和复发的 FFPE 标本的细胞异质性

总结

M20 Genomics 开发的该项新技术，可通过随机引物高灵敏度地捕获 FFPE 样本的全转录本的全长信息，将极大推动 FFPE 样本或其他降解生物样本单细胞核转录组检测。

与传统单细胞技术相比，snRandom-seq 具有更低的双胞率，以及更高的基因检出数，且数据 5’-3’ 覆盖度均一，在单细胞水平、单基因水平的覆盖度高于其他两种 FFPE snRNA-seq 方法。本文中，利用 snRandom-seq 方法，作者探究了小鼠以及人类临床肿瘤 FFPE 样本的细胞异质性，并可进行精细分群以及生物功能预测。由于 snRandom-seq 可捕获全转录本的全长信息，更适合进行 RNA 速率分析、非编码 RNA 分析等。

M20 Genomics 已于 2022 年八月向市场推出基于 M20 Seq 技术的 VITA 系列高通量单细胞全长转录组平台，并在同年 12 月份与欧易生物签订战略合作协议，携手打造基于 M20 Seq 技术的新一代单细胞技术（Next Generation Single Cell technology，NGSC）生态合作体系，以推动 VITA 平台在科研、临床和制药等领域的商业化应用。

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内容审核：邹礼平项目审核：周育红

题图来源：图虫创意

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