红松(Pinus koraiensis)在我国主要分布于长白山及其北部的张广才岭、老爷岭、完达山和小兴安岭(马建路等，1992)，既是优良的用材树种，也是珍贵的食用干果和油料树种。红松为二倍体(2n=24)裸子植物；球果圆锥状卵形，花期6月，雌雄同株，风媒传粉，球果生长期2年，于翌年9—10月成熟。我国具有丰富的红松资源，自20世纪80年代开展红松的遗传改良工作，在分布区内陆续营建初级种子园、子代测定林及改良代种子园，但前期的遗传改良工作主要依据表型选择，生长发育、生态习性等，育种周期较长(张振等，2014；施季森，2012)。遗传标记手段在杂交育种、种质资源保存、新种质挖掘等方面优势明显(Milee et al.， 2008)，在红松的育种工作中围绕现代分子育种技术已开发出来的分子标记，缺乏共显性的遗传标记，尚不能满足红松分子标记辅助育种的需要。

鉴定试验材料的遗传多样性是研究物种起源进化、发现新的基因资源、改良现有育种材料的基础工作。随着高通量测序技术的发展，EST数据不断增加，不少研究者基于转录组或公共数据库挖掘EST-SSR，在品种鉴定及改良、资源分析、遗传图谱构建、功能基因发掘等方面得到了广泛应用(Yi et al.， 2006;Portis et al.， 2007;Zhang et al.， 2013;杨秀艳等，2011)。简单序列重复(simple sequence repeats，SSRs)，又称为微卫星DNA(microsatellite DNA)，是一类由1～6个核苷酸串联重复组成的DNA序列(Kalia et al.， 2011)。SSR标记具有多态性高、重复性好、共显性、易检测、操作简单等优点，在DNA指纹图谱的构建、遗传多样性分析、基因定位、分子标记辅助育种等方面得到广泛应用(罗冉等，2010)。SSR荧光标记毛细管电泳法是基于DNA测序仪为平台的检测方法，具有高效自动化等技术优势，冯锦霞等(2011)、李雄伟等(2013)、陈雅琼等(2011)、程本义等(2011)分别于杨树(Populus)、桃树(Prunus persica)、烟草(Nicotiana tabacum)、水稻(Oryza sativa)中比较得出，在同一检测成本上，荧光标记技术检测效率高于银染法，结果更为精确灵敏。SSR标记主要包括基因组(gSSR)和表达序列标签SSR(EST-SSR)。表达序列标签直接反映基因的表达信息，EST数据来源于基因的转录区域，其多态性可能与基因功能直接相关，因此，比gSSR标记具有更高通用性(Eujayl et al.， 2002;Nicolai et al.， 2012)。本实验室利用获得的红松转录组数据，开发EST-SSR标记，同时对其组成、分布及特征进行分析，进一步开发出适用于红松的SSR标记，并以4个种子园的53个自由授粉子代为材料进行EST-SSR遗传变异分析。

转录组测序样本为黑龙江省林口县青山林场红松种子园内无性系‘LK15’与无性系‘LK20’的针叶、嫩梢、雌花和球果，液氮速冻后送百迈克基因公司(北京)进行全转录组的Illumina高通量深度测序，共包含41 476条Unigenes。

SSR扩增用的53份红松样本分别来自1979年于黑龙江省苇河、铁力、鹤岗和林口营建的嫁接种子园(表 1)，种子园亲本来源：苇河青山为鹤北优树，鹤岗为五营优树，林口青山为当地人工林优树，铁力为五营优树。造林株行距为4 m×6 m，无性系错位排列。每个无性系将采集后的球果晾干、制种，于2013年冬进行催芽处理。

表 1红松试验材料

Tab.1 Pinus koraiensis accessions used in this study

1)样本DNA提取每个无性系选取1个无病虫害的单株嫩苗，采用世阳生物公司新型植物基因组提取试剂盒提取红松基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，-20 ℃保存备用。

2)红松转录组SSR位点的鉴别及SSR引物设计对红松的针叶、嫩梢、雌花和球果的41 476条Unigenes，利用MISA软件(Guo et al.， 2010)查找SSR位点。查找标准:二、三、四、五、六核苷酸的最小重复次数分别为6，5，5，5，5次。用Primer5软件进行引物设计。

3)引物筛选与PCR扩增按照SSR引物设计原则，对含1 757个SSR位点的EST序列进行引物设计，舍去引物合成不理想的序列，最终合成101对SSR引物(北京鼎国昌盛生物技术公司)，SSR位点包括2～5个核苷酸重复单元。PCR反应体系为25 μL：模板DNA(25 ng·μL-1)2.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，1 U Taq酶0.5 μL，引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，ddH2O 18.5 μL。PCR扩增程序： 95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，最佳退火温度30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。每个种子园选用1个DNA模板对101对引物进行扩增检验。PCR产物首先采用2%琼脂糖凝胶电泳进行初步检测，舍去无扩增产物的引物，之后在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离检测。收集扩增产物，送测序验证(上海生工生物工程有限公司)。选择出扩增反应稳定、条带清晰、具有多态性位点的6对引物，进而合成荧光标记引物。PCR扩增后，取1 μL PCR产物，加入8.5 μL去离子甲酰胺、0.5 μL ROX-500分子量内标，95 ℃变性5 min，于4 ℃保温10 min，3 000 r·min-1离心1 min，于ABI3730 DNA分析仪上进行毛细管电泳，并收集数据。

4)数据分析用GeneMapper 4.0软件对收集的原始数据进行分析，系统将各峰值的位置与其泳道中的Rox-500分子质量内标予以比较，读取SSR标记片段大小，按照大写英文字母顺序记录等位基因，即同一位点最大的等位基因记为A，其余等位基因则依次记为B，C，D等，若只有1条峰值，则按照纯合基因型处理。用POPgene1.31软件(Yeh et al.， 1999;Nei，1973)统计分析等位基因数(Na)、Shannon信息指数(I)，利用PowerMarkerV3.25软件(Liu et al．，2005)计算多态性信息量(PIC)。

从红松转录组的41 476条Unigene序列中发现1 757个SSR位点，分布在1 549个Unigene中，发生频率(含有SSR的Unigene数量与总Unigene数量之比)为3.74%，其中，含2个及2个以上的SSR位点的Unigene序列有56条，1 493条序列含1个SSR位点，SSR的分布频率(SSR的个数与总Unigene的数量比)为4.24%，红松转录组序列中平均17.38 kb发现1个SSR位点。红松转录组中SSR种类包括一至五核苷酸重复类型，主要集中在一至三核苷酸重复类型上，占SSR总量的98.68%(表 2)。

表 2红松转录组中SSR重复单元的分布特征

Tab.2 Distribution of the SSR motifs in Pinus koraiensis transcriptome

红松转录组SSR位点的序列平均长度为13.94 bp，二、三、四、五核苷酸重复的平均长度分别为11.81，14.34，16.37，21.11，20 bp。如图 1所示，重复序列长度10～14 bp最多，达到52.82%，其次为15～18 bp(37.56%)，19～22 bp(7.63%)，>23 bp(1.94%)。SSR重复单元的重复次数分布在5～24次之间，如图 2所示，5～10次重复的最多，占75.41%。

1 757个SSR位点共包含31种重复基元，其中，一、二、三、四、五核苷酸重复基元分别有4，4，10，9，4种。从出现频率来看，频率较高的前5种重复基元分别为A/T，AT/AT，AGC/CTG，AGG/CCT，AAG/CTT，分别占总SSR位点数的46.1%，10.76%，7.63%，6.66%，6.55%，共占总SSR位点数的77.7%。

参试的101对引物中有21对引物扩增可检测出多态性位点，占引物总数的20.8%。然后利用检测出多态性位点的21对引物，进行PCR扩增，收集扩增产物，测序验证。通过测序验证表明，21对引物扩增出的特异条带中有16对引物(表 3)能够扩增出目标序列，成功率为76.19%。

表 3SSR引物序列与重复类型

Tab.3 SSR primer sequences and repeat types

选取具有多态性的6对引物，合成荧光标记引物，对53个红松无性系DNA进行PCR扩增，用以检测红松种子园无性系的遗传多样性，图 3、图 4为引物P92、P79分别扩增4个模板的毛细管电泳图。采用GeneMapper4.0软件进行数据分析，53个样本在6个SSR位点检测到的遗传变异见表 4，6对引物共检测到18个等位基因，平均每对引物检测到3个等位基因，多态性信息量(PIC)为0.036 3～0.667 4，平均为0.325。根据Botstein等(1980)的理论，有2个标记为低度多态位点(0＜PIC＜0.25)，3个标记为中度多态位点(0.25＜PIC＜0.5)，剩余1个为高度多态位点(PIC＞0.5)，P63位点PIC最高(0.667 4)。

表 4SSR引物的扩增产物及其多态性分析

Tab.4 The SSR primers amplified products and their polymorphism

红松属于基因组序列比较庞大的裸子植物，本研究从红松41 476条Unigene序列发掘出1 757个SSR位点，平均17.38 kb发现1个SSR位点，SSR的分布频率(SSR的个数与总Unigene的数量比)为4.24%，小于杨树(Populus)(14.83%)(张新叶等，2009)、油茶(Camellia)(6.7%)(温强等，2013)等树种，与火炬松(Pinus taeda)(4.32%)(林元震等，2009)、马尾松(Pinus massoniana)(3.62%)(刘公秉等，2009)、日本落叶松(Larix kaempferi)(3.85%)(杨秀艳等，2011)相当。参试的101对引物中有21对引物扩增可检测出多态性位点，占引物总数的20.8%。在对不同树种的研究中，EST中含有SSR重复序列的比例及类型有差异，本研究可扩增出多态性位点的引物重复单元以二、三核苷酸重复为主。由于密码子以三核苷酸为一个功能单位，因此，三核苷酸位移对一个表达基因的阅读框不会造成太大影响，所以在EST序列中发现三核苷酸重复的SSR类型最多，在大多数物种中均以二核苷酸和三核苷酸是最常见的转录组SSR重复单位类型(Varshoey et al.， 2002)，本研究结果印证了这一点；本研究以三核苷酸重复较多，占SSR总数的34.66%，二核苷酸重复占SSR总数的17.12%。同时验证了低级单元SSR的多态性普遍高于高级单元(Dreisigacker et al.， 2004)的推断，因此在设计SSR引物时应侧重于含低级单元的序列。

开发出6对引物用于53个红松子代家系的多态性检测分析，结果表明平均等位基因数为3.0，Shannon信息指数为0.654，多态性信息量(PIC)平均值为0.325，检测基因多样性水平的结果与张悦等(2013)研究红松微卫星标记相似。这些结果说明基于红松转录组序列开发和筛选出的EST-SSR引物可用于红松育种资源的遗传多样性评价。

EST-SSR在构建种质资源遗传多样性评价与保护等研究中具有很大优势，但同时它也存在一定的缺陷，由于EST-SSR来自相对保守的功能基因序列，因此与Genomic SSR标记相比较，EST-SSR标记的多态性较低(Eujayl et al.， 2001)；SSR分子标记多态性是基于扩增片段中不同的微卫星重复数目产生的，但对于长度相同而由不同碱基重复序列组成的SSR或者长度相近的SSR不能有效加以区分。随着公共数据库中不断增加的EST序列开发新的EST-SSR标记，及基于高通量测序技术更为有效地获得EST序列，有助于增加多态性SSR引物的数量，从而弥补EST-SSR标记本身多态性较低的问题；同时，结合其他分子标记如AFLP，SNP等进行比较研究，可以提高试验的可靠性和准确性。本研究采用ABI3730 DNA分析仪对6对荧光SSR引物所扩增的PCR产物进行毛细管电泳片段分析，克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳方法中人工估算片段大小所造成的误差，试验结果更加客观。然而更多了解红松资源之间的遗传信息和遗传关系，还需要使用更多的SSR标记。本项研究印证了利用红松转录组数据开发SSR标记的可行性，同时采用荧光标记技术检测红松自由授粉子代材料，为红松种质资源遗传多样性分析、分子标记辅助育种、遗传图谱构建和功能基因的挖掘等奠定了基础。