大家好！今天给大家介绍一篇2023年发表在Cell & Bioscience（IF:9.584）上的一篇文章。本研究作者对多发性骨髓瘤患者和正常人的组织进行单细胞转录组测序，描绘多发性骨髓瘤患者的单细胞图谱。

Dynamic single-cell RNA-seq analysis reveals distinct tumor program associated with microenvironmental remodeling and drug sensitivity in multiple myeloma

动态scRNA-seq数据分析揭示多发性骨髓瘤的不同肿瘤程序相关免疫微环境重塑和药物敏感性

背景：多发性骨髓瘤（MM）是一种以恶性浆细胞无性增殖为特征的血液恶性肿瘤。尽管，目前有关MM的研究很多但是MM中驱动药物敏感性和临床结局的分子机制仍然不是十分清楚。

结果：使用scRNA-seq数据分析3例健康人和以VCD治疗前后的10例MM患者的肿瘤异质性和分子动力学。作者发现，在VCD治疗2个周期后，未折叠蛋白反应和代谢相关程序减少，而应激相关和免疫反应程序增加。此外，肿瘤细胞免疫反应的低表达与MM不良药物反应和生存期较差有关，这可能是由于MHC I类介导的抗原呈递和免疫检测下调以及与免疫逃逸相关的标记物上调导致的。此外，免疫细胞分析表明，肿瘤内在免疫反应程序和微环境中免疫抑制表型的相关性。YBX1表达于骨髓瘤中免疫激活信号下调和免疫细胞浸润减少有关，从而导致预后不良。

结论：作者在单细胞分辨率下分析了MM在靶向治疗过程中肿瘤和免疫重编程，并鉴定到了整合肿瘤信号和免疫微环境变化的肿瘤程序。

1. 正常组织和MM患者的scRNA图谱作者对10例MM患者和3例健康组织的BM和外周血进行scRNA-seq（图1A）。经过批次校正和聚类后共获得241440个细胞，鉴定到T细胞，NK细胞，浆细胞，髓系细胞，B细胞和前体细胞等13种细胞类型（图1B）。UMAP分析可以将免疫细胞与浆细胞/骨髓瘤细胞分开，浆细胞的PC打分较高（图1C）。

2. MM的肿瘤内和肿瘤间异质性为了更好的理解正常浆细胞（nPCs）和骨髓瘤细胞的转录特征，作者对PCs进行重聚类共鉴定到20个簇（图1D）。聚类结果表明MM患者之间存在较强的转录异质性且MM患者中存在多个nPCs（图1D）。为进一步研究肿瘤内的异质性（ITH），作者分别对每个MM样本的PCs进行重聚类，结果表明每个患者的聚类簇随着细胞数量的增加而增加。接下来，作者使用DEPTH包计算每个患者的肿瘤细胞的ITH打分，结果表明每个患者ITH打分显著不同。

3. 治疗后4个恶性细胞程序出现异常药物诱导的变化可能是揭示化学疗法作用的分子机制的关键。因此，作者研究VCD治疗前后骨髓瘤细胞的基因表达谱变化。在治疗2个周期后，每个患者表现出不同程度的肿瘤细胞丰度降低（图2A和2B），大多数患者表现出较好的部分缓解（VGPR）或部分缓解（PR）。随后，作者鉴定每个患者治疗前和治疗后的肿瘤细胞中的差异表达基因（DEGs），DEGs数量在163到520个之间。使用功能富集分析鉴定到了可能影响化疗效果的四个细胞程序，包括未折叠蛋白反应（UPR），代谢相关，应激相关和免疫反应程序（图2C）。在治疗后的样本中，UPR和代谢相关程序下调（图2D），这表明化疗可能会杀死大部分具有高UPR和代谢状态的肿瘤细胞或者诱导这些细胞状态的抑制。应激相关特征包括应激反应基因，促生存基因和氧化应激基因（图2C）。治疗后应激反应的增加（图2D）表明，化疗在肿瘤细胞中引起应激反应并可能反过来帮助骨髓瘤抗眺望和药物靶向回复和细胞抗氧化能力从而促进耐药性。使用SCENIC绘制恶性肿瘤特异性调控网络并鉴定到与治疗相关的关键转录因子（图2E）。例如，在治疗后XBP1和STAT3表现出活性降低，而FOSB, MYC和YBX1活性上升。

4. 低免疫反应程序揭示MM的药物反应较差和预后较差通过对CoMMpass数据集的NDMM样本进行打分，鉴定到应激程序对患者预后有影响。因此，作者进一步关注免疫反应特征。通过研究KYDAR的scRNA-seq数据集鉴定到与接受联合治疗的有反应患者相比，无反应患者的免疫打分较低（图3A）。对PADIMAC的转录组数据集进行分析，免疫反应打分表明硼替佐米标准组的打分显著低于良好组（图3B），表明低免疫反应可能会损害药物敏感性。KM分析表明，低免疫反应打分与OS和PFS较差显著相关（图3C和3D）。

5. 免疫反应程序较低的肿瘤细胞表现出免疫逃逸表型接下来，作者研究具有免疫反应打分的肿瘤细胞的转录水平并鉴定他们之间的差异可能导致预后不良。首先，作者确定每个患者肿瘤细胞中免疫反应基因的表达打分并根据打分将分为高打分组和低打分组（图4A）。KEGG分析表明，免疫打分较低的患者中TNFα和IFN信号通路下调而细胞分裂，MYC信号通路和代谢过程相关的转录网络上调（图4B）。为进一步证实“免疫排斥”表型，作者检查调节免疫监视的基因的表达水平并鉴定到MHC I类分析表达显著降低（图4C）。免疫抑制基因的表达水平分析表明，低免疫应答骨髓瘤中免疫逃逸打分增加，CD47, LGALS1和TGFB1高表达（图4D）。

6. 肿瘤微环境中功能失调免疫细胞的特征接下来，作者研究治疗前后免疫细胞群的变化。作者鉴定每类细胞处理前后的DEGs和差异通路。随后，作者研究癌细胞免疫相关状态与肿瘤微环境中免疫细胞组成和功能的关系。再次，作者分析最常见的免疫细胞类型的功能差异。首先，作者从MM样本中提取T细胞并鉴定到11个亚型（图5A和5B），与高免疫反应肿瘤相比，CD8+效应T细胞和ifn反应T细胞以及NK细胞在低免疫反应状态肿瘤中表现出明显的衰竭打分，其特点是PDCD1, LAG3和TIM3高表达（图5C-5F）。此外，单核细胞也表现出免疫检查点和增殖基因的表达水平增加（图5E和5F）。GSE161801数据集的分析表明，骨髓瘤细胞中免疫反应激活特征与CD8+细胞毒性T细胞的共刺激打分和CD8+效应记忆T细胞正相关（图5G）。

7. YBX1参与MM的免疫应答，免疫细胞浸润和临床结局作者鉴定到转录因子YBX1在免疫反应状态较低的骨髓瘤细胞中上调表达并与MHC I类分子表达水平负相关，而与包括LGALS1和TGFB1在内的免疫抑制基因的表达正相关。这些结果表明YBX1可能是调节免疫反应程序的潜在因素。此外，与VGPR/PR患者相比，SD患者的YBX1上调表达（图6A）。与低表达YBX1组相比，YBX1高表达患者中多个生物学过程上调表达而免疫反应激活通路下调表达（图6D）。ssGSEA分析表明YBX1高表达患者的大多数TME组分显著低于YBX1低表达患者（图6E）。作者使用人骨髓细胞系和原发性骨髓瘤样本进行体外实验，敲除YBX1后，U266, OPM2和RPMI8226骨髓瘤细胞增殖显著降低（图6F和6G）。YBX1抑制后，原发性骨髓瘤细胞存活率下降（图6H）。

总的来说，作者的研究在单细胞水平上揭示了MM的异质性和肿瘤微环境图谱，并基于治疗前后的动态分析确定特定的转录程度。这些研究揭示了MM在治疗过程中分子和细胞的复杂性并为药物反应的治疗方案提供了潜在的分子生物标志物。然而，本研究的局限性在于本研究使用的数据集仅涉及到少量患者，无法全面了解骨髓瘤的发病机制和耐药性。因此，还需要更大规模的数据集进行进一步研究。