轨迹推断（Trajectory Inference，TI），是分析从千上万单细胞的组学数据中推断细胞发育轨迹的重要方法，也被称为伪时序分析 (pseudotime analysis)，该方法根据细胞表达模式的相似性对细胞进行排序。这为应用单细胞转录组学、蛋白质组学和表观组学数据研究细胞内的动态过程，如细胞周期、细胞分化和细胞激活等，提供了新的契机。

虽然轨迹推断工具已经有了七十多种，不过因为每个方法输入和输出模型差别很大，所以很难评判每个工具的性能。本篇文章通过对110个真实数据集和229个模拟数据集进行评估测试，分析比较了45种TI方法的细胞排序 (cellular ordering)结果、拓扑结构展示、扩展性和易用性。结果表明现有工具的互补性很好，各自有自己的适用范围，建议用户根据数据维度和轨迹拓扑结构挑选合适的方法。

由此本文总结了一套使用指南，可以帮助用户根据数据和分析需求选择最优方法。本文所有的测试数据和评估流程都可在https://benchmark.dynverse.org公开访问获得。该指南在帮助现有用户选择之余，对开发用于更大和更复杂的数据集的分析工具也有裨益。

110个实际单细胞转录组数据集和229个模拟单细胞转录组数据集：

在方法评估得分中，不同数据集的总体得分与包含金标准的真实数据集的得分具有中等至高度相关性（斯皮尔曼等级相关性在0.5-0.9之间），验证了黄金标准数据集和模拟数据集结果都有很好的代表性。

下图 a展示了评估的流程、评判标准和结果存储; b每种方法预测的轨迹与参考轨迹在拓扑结构、分支分配、细胞排序的水平进行比较评估；c展示轨迹的多种拓扑结构，包括闭合环形、线性、单分叉、多分叉、树形、连接图（多种轨迹并存）、断开图 (多种不相连轨迹并存)。

d图更详细的解释了4种计算标准。HIM得分 (Hamming–Ipsen–Mikhailov)通过考虑边的长度和度分布评判预测的轨迹与参考轨迹的拓扑结构相似度; F1(branch)评判两个轨迹中最相似分支所含细胞的相似度；Cor(dist)通过计算细胞之间配对物理距离评估两个轨迹中的细胞排序一致性；Wcor(feature)评估两个轨迹鉴定的差异表达基因的一致性。

45种TI方法根据它们所能推断的最复杂的拓扑结构分类，并展示了其是否依赖先验知识 (空白表示不需要，x是需要开始和终止细胞信息，x是需要细胞分组或time course信息)、Wrapper type (具体见https://github.com/dynverse/dynwrap)、运行平台、结果受算法或参数限制、可构建的拓扑轨迹类型、整体得分（准确性、拓展性、稳定性、易用性）。

整体来看得分最好的是PAGA, Slingshot, PAGA tree。线性拓扑方法中最好的是SCORPIUS。闭合环形拓扑中得分最好的是Angle。

热图展示了各个TI方法应用于不同的数据集、不同类型的拓扑轨迹时的准确性、多次运行时结果的稳定性、数据量增加时所需计算时间的变化、代码和文档的质量水平的得分。

不同的方法适用于不同的轨迹拓扑结构，而且受轨迹拓扑结构影响最大。

Slingshot应用于分析简单拓扑结构时效果最好，实际上它也倾向于预测对应数据的拓扑结构比较简单。PAGA,pCreode和RaceID/StemID在树形或更复杂的拓扑轨迹中效果更好。

可扩展性：随着需要处理的单细胞数据量和复杂度逐渐增加，各个工具的可扩展性也是评估的一个重要指标。

如图，列C是不同方法应用于不同数量的细胞和特征（no. of cells x no. of features）时所需的时间展示。颜色越深代表所需时间越长。k是thousands；m是million；cor是correlation，预测值和实际值的相关性值大小 （运行时间是数据集抽样时间的回归模型推测的）。

大部分方法都可以在12G内存的限制下工作，PAGA和STEMNET所需内存尤其少。

稳定性：两个相似的输入数据获得相似的轨迹预测结果。对一个数据集进行10次重抽样（抽取95%细胞，95%特征），评估同一个方法预测的轨迹的相似性，作为稳定性得分。

一种方法获得的结果准确性不高时，可以采用多种方法整合结果。下图展示了，采用1种、2种…多种方法组合后，获得最佳预测模型的可能性。从图中可以看出不同方法存在比较好的互补性，我们在实际分析时可以采用多种方法，整合分析结果。开发方法时，也可以做一个整合方法，优中选优。

根据评估，方法的准确性主要取决于发育轨迹的拓扑结构，所以选择合适的轨迹推断方法也受用户的先验知识对自己研究的数据可能的拓扑结构的预期。用户可以根据这个指南图和先验拓扑轨迹知识，结合软件的准确性、可用性和所需时间综合评估选择。具体可以在线使用guidelines.dynverse.org，可以动态探索和查询评估结果。

应用不同方法的关键是统一输入和输出数据，这样用户就可以简单的同时运行多种TI方法，比较不同方法的预测结果并进行下游分析。比如仅需使用几行R代码（https://methods.dynverse.org）就可以绘制如下图形。

每种方法预测的轨迹投射到一个共有的空间纬度，通过计算每对预测模型的相似性，选择平均相似性得分最高的模型作为一致性模型。对于线性轨迹和二分轨迹 (bifurcating)，方法已经比较成熟。而对树形结构、闭合环轨迹、断开图 (多种不相连轨迹并存)则还需要继续改善。